龟鲍曼不动杆菌和摩氏摩根菌双重PCR诊断方法建立

方振华，蒙美姑，党朝晖，洪美玲，丁 利

(1.海南职业技术学院 热带农业技术学院，海南 海口 570216； 2.海南师范大学 生命科学学院， 热带岛屿生态学教育部重点实验室，海南 海口 571158 )

甲、头肢部溃烂、蜕皮等[4,7,9]，给龟鳖养殖业造成了巨大的经济损失。感染摩氏摩根菌和鲍曼不动杆菌后，龟的临床症状及剖检病理变化较为相似，如腹甲、皮肤等溃烂，内脏出血等，发病迅速，严重时甚至导致龟鳖的大量死亡，有时两种致病菌呈交叉感染。但两种菌在临床治疗上有一定的差异，如龟源鲍曼不动杆菌对庆大霉素耐药，而摩氏摩根菌对庆大霉素敏感等。故两种菌的鉴别诊断对于临床治疗尤为重要。目前针对疾病的诊断依然采用传统的检测方法，但因其方法繁琐、工作量大、耗时长、敏感度低，远不能满足龟鳖养殖生产上的迫切需求。龟鳖疾病传统的诊断方法很难同时快速检测两种病原菌，临床鉴别诊断困难。因此研究灵敏度高、特异性强的PCR快速检测方法尤为迫切和必要。通过对龟鳖摩氏摩根菌和鲍曼不动杆菌及两种病原菌混合感染的快速鉴别诊断，可迅速明确病原菌，有针对性地指导用药，可为龟鳖养殖生产中该类疾病的预防和治疗提供参考和帮助。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

龟源鲍曼不动杆菌、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)及恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)均为实验室分离、鉴定并保存。

1.2 主要试剂

ExTaq酶(5 U/μL)购自Promega公司；组织基因组DNA提取试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司、DL2000 DNA Marker、dNTP等常规PCR试剂购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖为Sigma公司产品。

1.3 引物设计及合成

鲍曼不动杆菌rpoB基因和摩氏摩根菌gryB基因引物序列见表1，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物的核苷酸序列、扩增长度及登录号

1.4 DNA模板的制备

将冻存的鲍曼不动杆菌和摩氏摩根菌接种于LB 液体培养基中，过夜培养后将菌液离心，收集细菌沉淀，按照试剂盒说明书提取细菌DNA。

1.5 单重及双重PCR反应条件的优化

应用鲍曼不动杆菌rpoB基因和摩氏摩根菌gryB基因的特异性引物进行PCR扩增，应用胶回收试剂盒对PCR产物进行回收并进行序列测定。然后对双重PCR反应的退火温度、引物浓度、MgCl2浓度、dNTP浓度等进行优化。按25 μL反应体系：引物(10 μmol/L)分别为0.5 μL(0.2 μmol/L)、0.75 μL(0.3 μmol/L)、1 μL(0.4 μmol/L)和1.25 μL(0.5 μmol/L)，退火温度分别为55.0、55.5、56.4、57.7、59.3、60.6、61.5、62.0 ℃，dNTP(2.5 mmol/L)分别为0.5 μL(0.125 mmol/L)、1.0 μL(0.25 mmol/L)、2.0 μL(0.5 mmol/L)和3.0 μL(0.75 mmol/L)，MgCl2(25 mmol/L)分别为0.5 μL(1.25 mmol/L)、1.0 μL(2.5 mmol/L)、2.0 μL(5 mmol/L)和3.0 μL(7.5 mmol/L)进行反应条件的优化，每优化一项时保持其他条件不变。

1.6 双重PCR方法特异性试验

分别用龟源鲍曼不动杆菌、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯氏菌、维氏气单胞菌及恶臭假单胞菌DNA 作为模板，按1.5中优化好的反应体系及条件进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对该双重PCR方法的特异性进行分析。

1.7 双重PCR方法敏感性试验

提取鲍曼不动杆菌、摩氏摩根菌DNA，经超微量核酸分光光度计测定浓度。将2种菌的DNA等量混合，然后做10倍倍比稀释，以不同稀释倍数的DNA混合物为模板(2.0 μL)进行PCR扩增，以获得所建立的双重PCR方法的敏感性。

1.8 双重PCR检测方法的应用

采集海南省多家龟鳖养殖场病死龟肝脏等组织样本，参照试剂盒说明书中的操作步骤进行病料组织DNA的提取，以此为模板进行单重和双重PCR检测。

2 结 果

2.1 单重PCR扩增结果

利用设计好的鲍曼不动杆菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB基因特异性引物分别进行PCR扩增后，分别获得约401、917 bp大小的片段，与预期结果一致(图1)。经序列比对分析显示，获得的PCR产物与美国国立生物技术信息中心数据库中鲍曼不动杆菌rpoB基因及摩氏摩根菌gryB基因序列的同源性均在99%以上。

2.2 双重PCR反应条件的优化结果

通过对鲍曼不动杆菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB基因的引物浓度、退火温度、dNTP浓度、MgCl2浓度进行优化。试验结果显示，上、下游引物各为0.3 μmol/L时具有较好的扩增效果(图2a)；退火温度为55～59.3 ℃均能扩增出较清晰的条带，根据特异性原则，确定退火温度为59.3 ℃(图2b)；dNTP浓度为0.5 mmol/L；MgCl2浓度为5 mmol/L(图3)。

2.3 特异性试验

由特异性试验结果可知，鲍曼不动杆菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB出现2条清晰条带，大小分别约为401、917 bp，而龟源肺炎克雷伯氏菌、维氏气单胞菌及恶臭假单胞菌均未扩增出目的片段(图4a)。

2.4 敏感性试验

分别对摩氏摩根菌DNA(125.7 ng/μL)和鲍曼不动杆菌的DNA(41.2 ng/μL)进行10倍倍比稀释作为扩增模板，其中摩氏摩根菌DNA质量浓度依次为125.7、12.57、1.257、1.257×10-1、1.257×10-2、1.257×10-3、1.257×10-4ng/μL，鲍曼不动杆菌的DNA质量浓度依次为41.2、4.12、4.12×10-1、4.12×10-2、4.12×10-3、4.12×10-4、4.12×10-5ng/μL。模板等体积混合物(各1 μL)PCR产物经电泳分析表明，双重PCR方法对摩氏摩根菌最低检测质量浓度为1.257×10-3ng/μL，鲍曼不动杆菌最低检测核酸质量质量浓度为4.12×10-3ng/μL(图4b)。

2.5 临床样本检测结果

对临床32例疑似病料应用双重PCR方法检测发现，鲍曼不动杆菌感染12例，摩氏摩根菌11例(图5)，阳性检出率分别为37.5%和34.4%，混合感染5例，阳性检出率为15.6%(表2)，与单一PCR的阳性检出率一致。

图1 单重PCR扩增结果Fig.1 The amplification results of single PCR M.DL2000DNA marker; 1.鲍曼不动杆菌rpoB基因; 2.摩氏摩根菌gyrB基因. M.DL2000DNA marker; 1.rpoB gene of A. baumannii; 2. gyrB gene of M. morganii.

图3 双重PCR dNTP(a)和MgCl2浓度(b)优化结果Fig.3 The optimization of dNTP (a) and MgCl2 concentration (b) of duplex PCR a: M.DL2000 marker; 1.0.125 mmol/L; 2.0.25 mmol/L; 3.0.5 mmol/L; 4.0.75 mmol/L. b: M.DL2000 marker; 1.7.5 mmol/L; 2.5 mmol/L; 3.2.5 mmol/L; 4.1.25 mmol/L.

图4 双重PCR的特异性(a)和敏感性(b)检测结果Fig.4 The test results of specificity (a) and sensitivity (b) of duplex PCR a: M.DL2000 DNA marker; 1.鲍曼不动杆菌; 2.摩氏摩根菌; 3.鲍曼不动杆菌和摩氏摩根菌; 4.肺炎克雷伯氏菌; 5.维氏气单胞菌; 6.恶臭假单胞菌.b: M.DL2000Marker; 1～7.模板DNA依次稀释100～106倍. a: M.DL2000 DNA marker; 1.A. baumannii; 2.M. morganii; 3.A. baumannii and M. morganii; 4.K. pneumoniae; 5.A. veronii; 6.P. putida.b: M.DL2000Marker; 1—7.template DNA diluted by 100～106 times.

图5 临床样本双重PCR检测结果Fig.5 The test results of clinical samples by duplex PCR M.DL2000 marker; 1～32.临床样本. M.DL2000 marker; 1—32.clinical samples.

表2 临床样品单重和双重PCR检测结果

3 讨 论

龟鳖养殖因所需饲料、用量、人工、用地面积均较少，养殖回报率高，并且龟鳖具有较高的食用、药用和观赏价值等，已成为特种水产养殖的热点和经济增长点。在21世纪初发展迅猛，多种养殖模式在各省尤其是广东、广西、福建和海南得到迅速发展，形成了面积规模化、种类多样化、数量集约化的产业化模式[1-2,18]。龟鳖养殖蓬勃发展、贡献日益凸显的同时，也受到疾病的严重困扰和威胁。如鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、摩氏摩根菌等感染龟鳖后，可引起龟鳖发病，严重者可造成其大量死亡，给养殖业带来重大经济损失[4,7,19]。

3.1 摩氏摩根菌和鲍曼不动杆菌在龟鳖养殖业中的发病情况

摩氏摩根菌和鲍曼不动杆菌均属于条件致病菌，在水体、土壤及空气中广泛分布，可引起严重的感染，导致包括人在内的多种动物死亡[14,20]。同时摩氏摩根菌和鲍曼不动杆菌也是严重危害我国龟鳖养殖业的重要传染病病原。如摩氏摩根菌感染黄喉拟水龟(Mauremysmutica)可致其死亡[9-10]，摩氏摩根菌可导致中华鳖(Trionyxsinensis)感染头面部疖疮及出血性肠道坏死疾病[7-8]；鲍曼不动杆菌感染龟主要引起背腹甲糜烂、溃疡，内脏出血等病症[4]，感染中华鳖引起穿孔病、腐皮病、溶血性腹水病等症状[21]。由目前的多例病理报道不难发现，龟鳖感染摩氏摩根菌和鲍曼不动杆菌后，临床症状及病理变化较为接近，而且本课题组在多年的研究中也发现，这两种菌感染率和发病率均较高，并时常呈现交叉感染，给临床鉴别诊断和防治造成了严重的困难。尤其是目前龟鳖细菌性疾病多依赖抗生素进行防治，而抗生素的频繁使用，导致耐药菌株不断出现，使疾病的诊治愈来愈困难和复杂[5]。同时龟鳖疾病的研究起步相对较晚，研究基础较为薄弱，针对病原菌的诊断，多是采用传统的检测方法，如病原菌分离、形态学观察、理化鉴定等。此类方法工作量大、繁琐、耗时长，远不能满足龟鳖养殖生产的迫切需求，虽然目前也有针对鲍曼不动杆菌和摩氏摩根菌的分子生物学诊断方法[4,10]，但多是针对单一病原菌的PCR检测。因此研究灵敏度高、特异性强的龟鳖病原菌快速诊断技术和方法尤为迫切和必要。

3.2 龟源摩氏摩根菌和鲍曼不动杆菌诊断方法的建立

gyrB基因和rpoB基因常分别被应用于摩氏摩根菌和不动杆菌属菌种分类及鉴定[22-23]。故笔者选用此两种基因设计引物，均获得特异性目的条带，通过对PCR反应体系的优化，建立了快速鉴别诊断摩氏摩根菌和鲍曼不动杆菌及其混合感染的双重PCR诊断方法。此外，为检验该双重PCR方法的特异性，本试验选用了龟鳖养殖中常见的一些病原菌如龟源维氏气单胞菌、恶臭假单胞菌及肺炎克雷伯氏菌。虽然已有报道嗜水气单胞菌可引起龟鳖发病，但近几年并未在龟鳖养殖场筛查出该菌，故检验双重PCR方法特异性试验时未选用嗜水气单胞菌。由特异性结果发现该方法对上述致病菌均无扩增，说明该方法的特异性较高。此外，本方法的检出率与单一PCR方法无差异。

4 结 论

本试验所建立的针对两种病原菌检测的双重 PCR方法具有较强的特异性，仅对摩氏摩根菌和鲍曼不动杆菌有扩增，对其他病原菌如肺炎克雷伯氏菌、维氏气单胞菌及恶臭假单胞菌等无扩增；此方法灵敏度高，对鲍曼不动杆菌和摩氏摩根菌最低检测质量浓度分别为4.12×10-3ng/μL和 1.257×10-3ng/μL，在临床病料的检测上与单一PCR检测结果一致。该方法可为龟鳖类鲍曼不动杆菌和摩氏摩根菌的鉴别诊断和临床调查提供帮助。