投喂虾青素对哲罗鲑虾青素含量和抗氧化力的影响

2021-01-28张立颖李文通杨贵强

水产科学 2021年1期

张立颖，赵萌，李文通，袁丁，杨贵强

(北京市水产科学研究所暨国家淡水渔业工程技术研究中心，北京 100068 )

哲罗鲑(Huchotaimen)，属鲑形目、鲑科、哲罗鲑属，是少数几种能长到数百千克的大型淡水经济鱼类之一[1-2]。目前，哲罗鲑全人工繁殖和苗种驯化等关键问题已经解决[3]，其人工养殖规模正在逐步扩大，哲罗鲑的养殖推广为广大养殖户带来了良好的经济效益。鲑的肌肉红色程度被认为是评价其品质的重要指标，肌肉的红色主要来自虾青素的沉积[4]，由于自身不能合成[5]，因此人工养殖时必须在饲料中添加虾青素，以改善肌肉颜色，满足市场需求。虾青素的结晶或溶液能与蛋白质相互作用形成虾青素—蛋白复合体[6]，从而产生不同的颜色，可大幅度提高鲑的鱼肉品质。雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)中虾青素含量为1.5%～3.0%，是目前公认的天然虾青素最好的生物来源[7-8]。雨生红球藻中虾青素的结构以3S，3′S型为主，与鲑科鱼类等水产生物体内虾青素结构基本一致[9]，因此其生物吸收效果较好。天然虾青素独特的分子结构，使其具有强大的清除氧自由基、抑制单线态氧的能力[10]，是一种比β-类胡萝卜素、维生素E更有效的抗氧化剂[11]。

目前关于鲑肌肉着色的研究在国内外已有较多报道。张娟娟等[12]发现，虹鳟(Oncorhynchusmykiss)饲料中添加100 mg/kg人工合成虾青素，可使肌肉达到着色要求，虾青素的沉积率随时间延长而下降；Albrektsen等[13]发现，蓝鳕(Micromesistiuspoutassou)的鱼骨水解物可改善大西洋鲑(Salmosalar)肌肉对人工合成虾青素的利用率；石焜等[14]认为，雨生红球藻藻渣可以作为人工虾青素的有效着色替代品添加到虹鳟饲料中。人工合成虾青素作为着色剂添加到鲑鳟鱼饲料中存在添加成本高、利用率较低的现象，目前亟需研究和开发利用率较高的天然虾青素。笔者以哲罗鲑为试验对象，在饲料中添加人工合成虾青素和不同含量的雨生红球藻，研究雨生红球藻中天然虾青素对哲罗鲑肌肉虾青素含量和抗氧化的影响，以期获得天然虾青素在哲罗鲑中的最适添加量和作用时间，初步探讨虾青素抗氧化的作用机制，为雨生红球藻作为饲料添加剂提高哲罗鲑肌肉品质研究提供理论和参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲料

人工合成虾青素为购自广州某公司的饲用虾青素，对照组虾青素添加量为100 mg/kg；天然虾青素为购自荆州市天然虾青素有限公司的饲料用天然虾青素粉(雨生红球藻粉)，虾青素含量2%～2.3%，试验各组设计虾青素添加量分别为10、20、40、60 mg/kg。参照SN/T 2327—2009中检测方法，测定各处理组中虾青素实际含量依次为101.68(对照组)、10.27、20.39、41.03和61.32 mg/kg。除虾青素外其他成分与基础饲料营养相同；将基础饲料粉碎，过40目网筛，添加饲用虾青素粉或雨生红球藻粉、黏合剂及蒸馏水，重新挤压制成粒径4 mm的虾青素强化沉性颗粒饲料，晾干后2～5 ℃保存，1周内投喂，基础饲料组成见表1。

表1 饲料配方及常规营养成分

1.2 试验鱼及日常管理

试验鱼由北京市水产科学研究所玉渡山冷水鱼基地繁殖培育，平均体质量(435.63±21.32) g，试验分为1个对照组和4个试验组，每组3个平行，每个平行选取体质健壮、外表无伤的受试鱼500尾，共7500尾。试验鱼运至北京市水产科学研究所十渡基地后，暂养1个月。试验开始后分池饲养于15个6 m×2.5 m×1.2 m长方形水泥池中，流水养殖；投喂量约为试验鱼体质量的1%，以30 min内摄食完为宜，日投喂2次(10:30，16:30)；试验期间水温12～18 ℃，溶解氧>6 mg/L，pH 7.0～7.8。养殖周期为70 d。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 虾青素含量测定

试验开始后分别在第2周、第4周、第6周、第8周、第10周于每个平行取试验鱼3尾，用0.3‰的苯氧乙醇麻醉后，在鱼侧线以上的背脊白肌部分取约5.0 g的肌肉2块，立即冻存于-20 ℃冰箱，待试验结束后统一送至英格尔检测技术服务(上海)有限公司测定虾青素含量，检测方法参照SN/T 2327—2009《进出口动物源性食品中角黄素、虾青素的检测方法》。

1.3.2 抗氧化力指标测定

采用南京建成生物科技研究所试剂盒检测总抗氧化能力和碱性磷酸酶活性，通过722型可见分光光度计进行比色定量测定。饲养试验结束后，每个平行抽取试验鱼3尾，用0.3‰的苯氧乙醇麻醉后，尾静脉抽血，8000 r/min冷冻离心机离心10 min，上层是血清，下层是血细胞，分别取2份血清和血细胞各0.5 mL，4 ℃保存备用，供总抗氧化能力测定和碱性磷酸酶测定；分别取2份0.2 g鳃、肝脏、前肠、后肠、幽门垂、肌肉，用0.85%冰生理盐水冲洗2～3遍，再用吸水纸吸干表面的水分，2份均与0.85%冰生理盐水按1∶4(体积比)在4 ℃冰水浴条件下用手动玻璃匀浆棒研磨均匀，制成20%的组织匀浆液，冷藏备用，供总抗氧化能力测定和碱性磷酸酶测定。

1.3.3 数据统计与分析

试验数据以均值±标准误表示，采用SPSS 23.0统计软件进行单因素重复测量的方差分析和Duncan氏法多重比较，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 虾青素含量

随着试验的进行，各处理组肌肉中虾青素含量先逐步升高，6～8周后虾青素含量趋于稳定(图1)。各处理组间肌肉虾青素含量有差异。与对照组相比，20 mg/kg组和40 mg/kg组的虾青素含量显著上升(P<0.05)，而且40 mg/kg组的虾青素含量显著高于20 mg/kg组(P<0.05)；10 mg/kg组和60 mg/kg组的虾青素含量差异不显著(P>0.05)，同时10 mg/kg组和60 mg/kg组间的虾青素含量差异也不显著(P>0.05)。

图1 各处理组哲罗鲑肌肉中虾青素含量的变化Fig.1 Changes in astaxanthin contents in muscles of taimen H. taimen in each group

2.2 不同组织的总抗氧化能力

投喂雨生红球藻对哲罗鲑各组织的总抗氧化能力影响见图2。试验组哲罗鲑各组织(肌肉组除外)的总抗氧化能力显著高于对照组(P<0.05)；并且随着雨生红球藻添加量的增加，各组织的总抗氧化能力呈现先升后降的趋势。其他组织的各处理组间天然虾青素增强总抗氧化能力效果有差异。与对照组相比，4个试验组哲罗鲑鳃、肝脏、前肠、后肠、幽门垂、血清、血细胞的总抗氧化能力均显著高于对照组(P<0.05)，40 mg/kg组肌肉、鳃、肝脏、后肠、幽门垂、血清的总抗氧化能力最高，显著高于其他试验组(P<0.05)，40 mg/kg组哲罗鲑血细胞的总抗氧化能力显著高于10 mg/kg组和60 mg/kg组(P<0.05)。

2.3 不同组织的碱性磷酸酶活性

投喂雨生红球藻对哲罗鲑各组织碱性磷酸酶活性的影响见图3。试验组哲罗鲑各组织的碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)；并且随着雨生红球藻添加量的增加，各组织的碱性磷酸酶活性大部分呈现先升后降的趋势。8种组织各处理组间天然虾青素增强总抗氧化能力效果存在差异。4个试验组哲罗鲑鳃、后肠、幽门垂、肌肉、血清、血细胞的碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)，20 mg/kg组和40 mg/kg组哲罗鲑肝脏、前肠的碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)；40 mg/kg组哲罗鲑前肠、幽门垂、肌肉、血清、血细胞的碱性磷酸酶活性显著高于其他试验组(P<0.05)，40 mg/kg组哲罗鲑鳃的碱性磷酸酶活性显著高于20 mg/kg组和60 mg/kg组(P<0.05)，40 mg/kg组哲罗鲑肝的碱性磷酸酶活性显著高于10 mg/kg组和20 mg/kg组(P<0.05)，40 mg/kg组哲罗鲑后肠的碱性磷酸酶活性显著高于10 mg/kg组和60 mg/kg组(P<0.05)。

3 讨论

3.1 肌肉中虾青素含量

鲑鳟鱼类的肌肉红色程度是评价其品质的重要指标，但其自身不能合成虾青素[11]，因此，常在养殖过程中添加虾青素，通过虾青素与鱼肌肉中蛋白质相互作用形成虾青素—蛋白复合体来改善其肌肉色泽。本试验中，在饲料中添加100 mg/kg人工合成虾青素，试验鱼肌肉中虾青素含量3.9～4.7 mg/kg；在饲料中添加20～40 mg/kg天然虾青素(雨生红球藻源)，试验鱼肌肉中虾青素含量4.1～5.1 mg/kg(图1)，相较于对照组显著较高(P<0.05)，这与雨生红球藻藻渣用于着色虹鳟的研究结果[14]一致，推测这可能是雨生红球藻虾青素可与肌红蛋白非特异结合[15]，具有极强的色素沉积能力；同时雨生红球藻中的虾青素以左旋结构3 S，3′S构型为主，与动物体内的虾青素旋光结构基本一致，可能有助于机体对虾青素的快速吸收和较高的利用率[16-17]；而人工虾青素旋光结构具有多种形式，其中n(左旋)∶n(消旋)∶n(右旋)=1∶2∶1[18]，这造成人工合成虾青素在功能上与天然虾青素有很大差异[19]，且在动物体内无法转化为天然构型[16]，所以人工合成虾青素的生物吸收效果不理想。本试验结果显著低于虹鳟的虾青素含量6.1～8.6 mg/kg[20-21]，这可能与鲑鳟的物种特性有关。在饲料中添加60 mg/kg天然虾青素(雨生红球藻源)，试验鱼肌肉中虾青素含量4.1～4.5 mg/kg与对照组相比，差异不显著(P>0.05)，这与Page等[22]的研究结果相同，其原因是鱼体摄入过多虾青素可能导致虾青素降解。因此，建议哲罗鲑饲料中天然虾青素(雨生红球藻源)的添加量为20～40 mg/kg。

3.2 抗氧化能力和免疫指标

近年来，关于虾青素的研究，逐渐转移到对机体抗氧化和免疫功能的影响上[20,25-27]。人工合成虾青素是一种重要的红色含氧类胡萝卜素，主要通过猝灭脂溶性自由基实现其抗氧化功能，其抗氧化活力是β-胡萝卜素的10倍、维生素E的100倍[6,23]。

图2 投喂雨生红球藻后哲罗鲑各组织的总抗氧化能力变化情况Fig.2 Changes in total antioxidant capacities of tissues in taimen H. taimen fed the diets containing green alga H. pluvialis

图3 投喂雨生红球藻后哲罗鲑各组织的碱性磷酸酶活性变化情况Fig.3 Changes in alkaline phosphatase activities of tissues in taimen H. taimen fed the diets containing green alga H. pluvialis

总抗氧化能力是用于衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标[24]，Zhang等[20,25]指出，在虹鳟饲料中添加100 mg/kg虾青素，可显著增强虹鳟肝脏总抗氧化能力。本试验中，4个试验组哲罗鲑鳃、肝脏、前肠、后肠、幽门垂、血清、血细胞的总抗氧化能力显著高于对照组(P<0.05)(图2)，上述结果表明，雨生红球藻中的天然虾青素比人工虾青素能更有效地提高哲罗鲑机体综合抗氧化能力，这与其具有共轭双键链及不饱和酮基和羟基的特殊分子结构有关，该结构能提供吸引自由基的未配对电子，从而有效地猝灭附近的自由基及有害的活性氧，起到显著的抗氧化功效[20-21,25]。

碱性磷酸酶是动物代谢过程中重要的调控酶，可催化所有磷酸单酯及磷酸基团的转移反应，直接参与磷的代谢，同时对水中钙质的吸收、磷酸钙的形成、甲壳素的分泌及形成均具有重要作用，是水产动物赖以生长、生存的重要酶类之一[26]。血清碱性磷酸酶存在于肠黏膜、骨骼、肝脏、肾脏、肺及血细胞中[27]。本试验中随着试验鱼血清中碱性磷酸酶活性升高，肝脏组织未发生病变,4个试验组哲罗鲑鳃、后肠、幽门垂、肌肉、血清、血细胞的碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)(图3)，说明添加天然虾青素可促进哲罗鲑细胞中的物质代谢，促进其生长，间接增强其非特异性免疫能力。40 mg/kg组碱性磷酸酶活力最高，表明该添加量的雨生红球藻使鱼体处于最佳的钙磷代谢状态，该结果与虾青素对锦鲤(Cyprinuscarpio)的影响作用[28]相一致。虾青素属于叶黄素类胡萝卜素，张茂华等[29]研究发现，钙和叶黄素在肉鸡肠道内吸收也存在竞争，高钙会抑制叶黄素吸收。在动物营养研究中，血清碱性磷酸酶活性常作为重要的生化检测指标协助评定日粮钙、磷水平的适宜程度[30]。刘侠等[31]研究发现，钙化在酶失活、缺乏Ca2+或PO43-的条件下不会发生，碱性磷酸酶对钙化的发生是必需的，碱性磷酸酶活性越高，钙化速度越快；同时，钙化会加速碱性磷酸酶失活，钙化速度越快，碱性磷酸酶活性降低越快。本试验中，60 mg/kg组过高的虾青素含量有可能在一定程度上使碱性磷酸酶失活，钙化速度减慢，造成碱性磷酸酶活性降低。因此，对不同的水产动物要给予不同的条件，保持其最高活力，以有利于动物的生长。