黑豆丹贝发酵前后香气、酚类物质及抗氧化活性分析

武 悦 赵 婧 王 坤 朱 丹 牛广财 魏文毅

(1黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319；3黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319)

丹贝是印度尼西亚传统的大豆发酵制品。在发酵过程中，少孢根霉(Rhizopus oligosporus)不仅使发酵的豆制品具有独特的风味，而且能增强其抗氧化性[1-2]。如Jeleń 等[3]利用气相色谱-质谱技术在发酵后的丹贝中检测出21 种香气成分，其主要芳香化合物有2-乙酰基-1-吡咯啉、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪二甲基三硫化物、甲氧基2-甲基丙醛和(E，E)-2，4-癸二烯醛；丁一[4]利用少孢根霉对添加高粱的大豆进行固态发酵，发现发酵样品中单宁含量较发酵前提高了近30倍，且具有更高的DPPH 自由基清除率、总抗氧化能力和还原能力。黑豆富含不饱和脂肪酸、氨基酸、黄酮、酚类物质等成分，具有比普通大豆更强的抗氧化性[5-6]。虽然黑豆营养丰富，但目前食用方式主要有豆豉、酱油等[7]，产品形式单一，且需要进一步提高其营养与保健价值。开发黑豆丹贝既能丰富丹贝的品种，又可以拓展黑豆的深加工途径。然而，目前关于黑豆丹贝制备工艺、营养成分及功能特性的系统研究尚鲜见报道。仅王丹丹[8]对黑豆丹贝发酵工艺进行优化，并对油炸黑豆丹贝相关指标进行了检测，但未涉及香气成分、酚类物质以及抗氧化活性等的研究。

鉴于此，本试验以黑豆为原料，少孢根霉为发酵菌株，对黑豆丹贝发酵前后的水分、灰分、蛋白质、脂肪、香气成分等指标进行检测，并对发酵过程中黑豆丹贝的蛋白质水解度以及麦角固醇、氨基酸态氮、10 kDa 以下肽、总酚、总黄酮和原花青素的含量进行测定，最后分析各类酚物质含量与抗氧化活性指标，即1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl) hydrazyl，DPPH]自由基清除率、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐阳离子[2，2-azinobis (3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt cation，ABTS＋]自由基清除率、羟基自由基清除率和铁离子还原力(ferric ion reducing antioxidant power，FRAP)之间的关系，旨在为黑豆丹贝的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料及试剂

黑豆，购于黑龙江省建三江农场；食品级乳酸，购于郑州高研生物科技有限公司；少孢根霉(Rhizopus oligosporus)，孢子数量在106个·g-1以上，购于南京天贝人发酵技术有限公司；色谱级甲醇，德国Darmstadt 公司；麦角固醇、DPPH、2，4，6-三吡啶基三嗪[2，4，6-Tris-(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ]、ABTS、水溶性维生素E(Trolox VE)，美国Sigma-Aldrich 公司；胰酪蛋白胨、β-巯基乙醇、芦丁、福林酚、没食子酸、儿茶素、香草醛、邻苯二甲醛、四硼酸钠、十二烷基磺酸钠、硫酸、硫酸铜、硫酸钾、乙酸镁、正己烷、正戊烷、乙醇、无水乙醚、石油醚、甲醇、过硫酸钾、氯化铁、浓盐酸等，均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

DGG-9140B 干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；LRH-150 型生化培养箱，上海益恒实验仪器有限公司；SX2-12-10 箱式电阻炉，上海实验电炉厂；JTXT-150S 索氏提取器，天津天玻玻璃仪器有限公司；UV-1100 型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器；湘仪L420 台式低速自动平衡离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；Agilent GC 6890-MS 5973N 型气相色谱-质谱联用仪、Agilent 1260 infinityⅡ高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；50/30 μm (DVB/CAR/PDMS)萃取头，美国Supelco 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑豆丹贝的制备 参照武悦等[9]的方法制备黑豆丹贝。其中，在塑料发酵袋(8 cm×12 cm)上扎孔(1.25 个孔·cm-2)，发酵袋及产品形态见图1。

图1 黑豆丹贝发酵袋(A)及黑豆丹贝产品(B)Fig.1 Fermentation bag of black bean tempeh (A)and its product (B)

1.3.2 基本营养成分测定 分别参照GB 5009.3-2016[10]、GB 5009.4-2016[11]及GB 5009.6-2016[12]测定水分、灰分及粗脂肪含量。粗蛋白含量测定参照GB/T 6432-2018[13]中的凯氏定氮法。

1.3.3 香气成分测定 参照丁一[4]的方法提取香气成分并进行分析。其中，程序升温是以10℃·min-1升至90℃，保持3 min；再以5℃·min-1升至140℃，保持1 min；最后以10℃·min-1升至230℃，保持8 min。溶剂延迟1 min，不分流进样。质谱(mass spectrometry，MS)条件:MS 离子源在225℃全扫描，电离方式:EI；扫描质量范围:50～500 amu。本研究仅报道匹配度大于80%以上的物质。

1.3.4 麦角固醇含量测定 参照吴寒[14]的方法略有更改。萃取后得到的上层清液需旋转蒸发至干，甲醇复溶后过滤膜待测。高效液相色谱分析条件:Supersil AQ-C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速1.0 mL·min-1，洗脱时间15 min。麦角固醇(0 ～200 μg·mL-1)标准溶液的线性回归方程为y=29.251x-74.065(R2=0.998 3)。

1.3.5 氨基酸态氮含量测定 参照GB 5009.235-2016[15]的方法测定。

1.3.6 蛋白质水解度测定 参考吴寒[14]的方法制备蛋白提取液。参照Wu 等[16]的方法测定黑豆丹贝发酵过程中蛋白质的水解度。

1.3.7 10 kDa 以下肽含量测定 对制备的蛋白质提取液进行10 kDa 以下肽含量的测定[14]。胰酪蛋白胨(0～20 mg·mL-1)作为标准物，线性回归方程为y=0.067 6x-0.061 9(R2=0.992 8)。

1.3.8 酚化合物含量及抗氧化活性测定 称取样品并用正己烷脱脂2 次(料液比1 ∶10 g·mL-1)[9]，每次1 h，然后7 000 r·min-1离心10 min，将沉淀烘干至恒重。之后加入乙醇溶液，置于45℃水浴中超声提取2 h 后7 000 r·min-1离心10 min，收集上清液[14]，待测。

1.3.8.1 总酚测定 采用 Folin-Ciocalteus 法测定[14]。没食子酸(0 ～250 μg·mL-1)标准溶液的线性回归方程为y=0.004 3x＋0.015 2(R2=0.999 2)。

1.3.8.2 总黄酮测定 参照陈虎等[17]的方法测定。芦丁(0～0.06 μg·mL-1)标准溶液的线性回归方程为y=14.980 4x-0.002 1(R2=0.993 0)。

1.3.8.3 原花青素含量测定 参照周芸[18]的方法测定。儿茶素(0～250 μg·mL-1)标准溶液的线性回归方程为y=0.003 7x＋0.011 3(R2=0.995 8)。

1.3.8.4 抗氧化活性相关指标测定 1)参照吴寒[14]的方法测定DPPH 自由基清除率。其中，DPPH 溶液用100%甲醇溶解。DPPH 自由基清除率用水溶性维生素E(Trolox)等价抗氧化能力表示，DPPH 自由基清除率与Trolox(0 ～50 μg·mL-1)标准溶液的线性回归方程为y=1.783x＋3.692 8 (R2=0.992 8)。

2)参照白海娜等[19]的方法制备ABTS＋溶液，然后进行ABTS＋自由基清除能力测定并计算清除率。Trolox(0 ～20 μg·mL-1)标准溶液的线性方程为y=14.079 8x-3.113 1(R2=0.990 6)。

3)采用南京建成羟基自由基测定试剂盒法测定羟基自由基清除能力并计算清除率。Trolox(0 ～20 μg·mL-1)标准溶液的线性方程为y=3.171 2x-1.017 1(R2=0.993 7)。

4)参照吴寒[14]的方法进行FRAP 的测定，结果以FeSO4当量表示。FeSO4(0 ～350 μmol·L-1)标准溶液的线性回归方程为y=3.442 9x＋0.034 0(R2=0.993 7)。

1.3.9 数据处理 利用SPSS 17.0 软件进行2 个样本独立T 检验，并对试验数据进行处理和分析，结果以平均值±标准差表示。数据多重比较采用Duncan法分析，并选用Pearson 相关系数法对活性成分和抗氧化各项指标进行相关性分析。所有试验均设置3 次重复。

2 结果与分析

2.1 黑豆丹贝基本营养成分分析

由表1 可知，发酵前后的黑豆丹贝灰分、粗脂肪含量差异不显著；水分、粗蛋白含量差异显著。发酵后黑豆丹贝粗蛋白含量由43.46%升至46.67%，这是因为微生物在生长繁殖过程中利用非蛋白氮合成菌体蛋白，从而提高了发酵产物的粗蛋白含量[20-21]。水分含量由58.49%降至56.61%，这可能是恒温培养致使黑豆丹贝中的自由水挥发导致的。

2.2 黑豆丹贝香气成分分析

由表2 可知，发酵前后样品中共检出29 种香气成分。

表1 黑豆丹贝发酵前后基本营养成分含量Table 1 Basic nutrients contents of black soybean tempeh before and after fermentation

发酵前样品可检出10 种香气物质，相对含量为70.12%；发酵后样品可检出24 种香气物质，相对含量为43.14%。

发酵前后样品中均检出的5 种烷类香气类物质，分别为1，1，1，5，5，5-六甲基-3，3-二乙氧基三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、四溴甲基环庚硅氧烷和六甲基环三硅氧烷。发酵后样品新增加3 种烷类风味物质，分别为1-(1，2-二甲基丙基)-1-甲基-2-壬基-环丙烷、二十八烷和十四甲基-环庚硅氧烷，其相对含量分别为0.59%、0.42%和3.17%。总体来说，1-(1，2-二甲基丙基)-1-甲基-2-壬基-环丙烷和二十八烷的相对含量较低，对黑豆丹贝风味贡献较小，十四甲基-环庚硅氧烷可能是微生物的代谢产物。

发酵前样品醇类物质有1-辛烯-3-醇、3-辛醇，其中1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气，3-辛醇呈蘑菇香气。发酵后，样品中这2 种物质未检出，检出异戊醇，此物质具有苹果白兰地香气，这可能是因为发酵过程中发生了氧化反应或酯化反应，导致1-辛烯-3-醇未检出，其他醇类的出现不同程度地丰富了黑豆丹贝的风味[4]。发酵前，样品中酮类物质有3-辛酮，其相对含量为9.18%，发酵后3-辛酮未检出，增加了5-甲基-3-庚酮和2，3-二氢-7-甲氧基-4-甲基-1H-1，5-苯二氮杂-2-酮，其中5-甲基-3-庚酮具有柠檬草的香气。发酵前后，苯类主要物质组成由2-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-1-异丙基-4-甲基苯变为1，3-二(三甲基甲硅烷基)苯，相对含量由1.19%降至0.15%，新苯类物质的出现丰富了黑豆丹贝的风味。发酵前，样品中2-正戊基呋喃的相对含量为6.55%，发酵后，2-正戊基呋喃未检出，新出现1-氨基环戊酰胺，使黑豆丹贝具有其典型的香味。

发酵后新增加的香气风味物质主要有醛、酯、烃类。其中异戊醛和壬醛的总相对含量达2.94%，使黑豆丹贝具有轻微的水果香气；1-硫代异氰酸戊酯、甲基肼甲二硫代酯、棕榈酸乙酯的总相对含量达9.39%，这些物质的出现使黑豆丹贝具有清冽的水果味道；双戊烯、(Z)-3-乙基-2-甲基-1，3-己二烯、香橙烯、马兜铃烯、雪松烯V6 和1-石竹烯的总相对含量为12.25%，令黑豆丹贝具有柠檬、柑橘、丁香的香气。

表2 黑豆丹贝发酵前后香气成分的GC-MS 分析结果Table 2 Analysis results of aroma components in black bean tempeh by GC-MS before and after fermentation

2.3 黑豆丹贝发酵过程中麦角固醇与氨基酸态氮含量的变化

麦角固醇是真菌细胞膜的主要组分，其含量变化可以在一定程度上反映少孢根霉菌丝的生长状况[22]。由图2-A 可知，发酵过程中黑豆丹贝的麦角固醇含量总体上呈现先上升后下降的趋势。发酵0 ～33 h 内麦角固醇含量逐渐上升至最大值(911.39 μg·g-1)，表明少孢根霉能够以黑豆为基质，持续快速的生长[22]；发酵33 h 后麦角固醇含量开始下降，并在发酵39 h 时下降至760.26 μg·g-1，这可能是因为随着发酵时间的延长，部分菌丝发生了自溶，从而导致麦角固醇的分解。

氨基酸态氮含量可反映蛋白质的水解程度，是判断传统发酵食品发酵程度的一项重要指标[14]。由图2-B 可知，发酵0～9 h 内氨基酸态氮含量呈现缓慢下降趋势，这可能是因为发酵前期微生物胞内蛋白酶尚未充分合成，而自身生长又需要氨基酸作为氮源。发酵9 h 后氨基酸态氮含量开始上升，从0.05 g·100g-1上升至0.87 g·100g-1，这是因为随着少孢根霉的生长，其自身分泌的大量蛋白酶可将蛋白质水解[1]，因此，可溶性氮含量增加。

图2 黑豆丹贝发酵过程中麦角固醇(A)、氨基酸态氮(B)含量的变化Fig.2 Changes of ergosterol (A) and amino acid nitrogen(B) content during fermentation of black soybean tempeh

2.4 黑豆丹贝发酵过程中蛋白质水解度与10 kDa 以下肽含量的变化

由图3-A 可知，在发酵初期(0 ～15 h)，黑豆丹贝蛋白质的水解度先下降后保持稳定，发酵15 ～39 h 期间，蛋白质水解度由4.85%显著上升至29.43%。天冬氨酸蛋白酶是根霉分泌的主要蛋白酶，它在酸性环境中具有更好的活性和稳定性。丹贝制作过程中，乳酸的添加为蛋白酶提供了良好的酸性环境[16，23]。因此，随着发酵的进行，蛋白酶不断增加，大分子物质分解成小分子物质，蛋白质水解度显著增加。

图3 黑豆丹贝发酵过程中水解度(A)与10 kDa 以下肽含量(B)的变化Fig.3 Changes of hydrolysis degree (A) and peptide content below 10 kDa (B) during fermentation of black soybean tempeh

与蛋白质水解度的变化趋势相似，发酵过程中黑豆丹贝10 kDa 以下肽含量总体呈先稳定后上升的变化趋势(图3-B)。发酵初期(0 ～15 h)黑豆丹贝的10 kDa 以下肽含量无显著变化，发酵15 ～39 h 时其含量从93.28 mg·g-1上升至335.60 mg·g-1，表明少孢根霉可以很好地促进黑豆蛋白质降解成小分子量的多肽。多肽是蛋白质水解的中间产物，具有极高的生物活性，可赋予丹贝多种生理功能，如抗氧化、抗肿瘤、抗高血压等[24-25]。

2.5 黑豆丹贝发酵过程中酚类物质的变化

由图4-A 可知，发酵初期(0 ～15 h)黑豆丹贝总酚含量基本维持在0.86～0.94 mg·g-1，这可能是因为在初发酵时，酚类物质大部分以结合态的形式存在。发酵15～33 h 时，总酚含量由0.94 mg·g-1显著上升至2.23 mg·g-1。33～39 h 时，发酵逐渐彻底，总酚含量基本维持在2.23 mg·g-1。

发酵中黑豆丹贝总黄酮含量呈上升趋势，由0.35 mg·g-1升至0.70 mg·g-1(图4-B)。这可能是因为，随着发酵时间的延长，微生物含量增加，其产生的酶催化类黄酮由结合态转为游离态[26]。

同样，发酵过程中(9 ～39 h)，黑豆丹贝中原花青素含量逐渐升高，由0.55 mg·g-1上升至2.22 mg·g-1(图4-C)。这可能是因为在发酵初始阶段，原花青素以高聚体的形式存在，然而，发酵过程中由于微生物的作用，导致原花青素由高聚体转为低聚体，其含量逐渐增加[27]。

图4 黑豆丹贝发酵过程中总酚(A)、总黄酮(B)、原花青素(C)含量的变化Fig.4 Changes of total phenol (A)，total flavonoids (B) and procyanidins(C) contents during fermentation of black soybean tempeh

2.6 黑豆丹贝抗氧化活性变化

由图5-A 可知，发酵15～27 h 时，DPPH 自由基清除率显著增加；发酵39 h 时，DPPH 自由基清除率达到最大值，为83.41%(每克黑豆丹贝冻干样品相当于0.45 mg Trolox)。可见，发酵后的黑豆丹贝对DPPH自由基的清除能力远大于未发酵样品。

由图5-B 可知，发酵15～21 h 时，ABTS＋自由基清除能力显著增强，清除率由79.84%提高至98.17%(每克冻干样品相当于0.072 mg Trolox)，发酵21 ～39 h 后ABTS＋自由基清除能力趋于稳定。黄士淇[28]利用少孢根霉发酵青刺果种子的研究结果显示，发酵后青刺果种子的ABTS＋自由基清除能力较发酵前显著提高，这与本研究结果一致。

由图5-C 可知，发酵0～21 h 时，羟基自由基清除率由76.75%提高至92.11%(每克冻干样品相当于0.29 mg VE)，发酵21 h 后，羟基自由基清除率趋于稳定。这与Sheih 等[29]利用黑霉M46 发酵大豆后，大豆胚芽的羟基自由基和超氧化物自由基的抗氧化活性提高的结论一致。

图5 黑豆丹贝发酵过程中DPPH 自由基清除率(A)、ABTS+自由基清除率(B)、羟自由基清除率(C)、FRAP(D)的变化Fig.5 Changes of DPPH radical scavenging rate(A)，ABTS+ radical scavenging rate(B)，hydroxyl radical scavenging rate(C) and FRAP (D) during fermentation of black soybean tempeh

由图5-D 可知，发酵0～21 h 内FRAP 变化不大，随后逐渐增加，至发酵33 h 时达到最大(7.18 μmol·g-1)，之后趋于稳定。说明发酵后的黑豆丹贝具有较强的FRAP。

2.7 黑豆丹贝活性成分与抗氧化能力相关性分析

由表3 可知，总酚和原花青素含量均分别与DPPH 自由基清除率和FRAP 呈极显著正相关(P＜0.01)，与ABTS＋自由基清除率和羟基自由基清除率呈显著正相关(P＜0.05)；总黄酮含量与DPPH 自由基清除率、ABTS＋自由基清除率、羟基自由基清除率呈极显著正相关(P＜0.01)，与FRAP 呈显著正相关(P＜0.05)，表明总酚、总黄酮和原花青素含量与抗氧化活性之间密切相关。上述结果与张杉杉等[30]研究发酵豆渣中总酚含量及抗氧化能力均显著升高且具有极显著相关性的结果一致。此外，Singh 等[31]研究表明，发酵后大豆较未发酵大豆的酚类物质、黄酮类物质含量和抗氧化能力均有提高，这可能和酚类、黄酮类物质与自由基反应的终止有关，也可以用于解释本试验中黑豆丹贝具有较强的清除自由基的能力。

表3 总酚、总黄酮、花青素含量和抗氧化能力的皮尔森相关分析Table 3 Pearson correlation analysis of total phenol，total flavonoids，anthocyanin content and antioxidant capacity

3 讨论

通常少孢根霉(Rhizopus oligosporus)发酵后的黑豆丹贝中醛类、酯类、烃类等香气成分较多[32]。本研究中黑豆丹贝发酵后新检出的壬醛、棕榈酸乙酯及1-石竹烯等香气成分，赋予其独特的味道，并且有淡淡的玫瑰香味和水果香气。此外，异戊醇的出现赋予丹贝清香的味道[33]。发生这种香气变化的机制可能是，少孢根霉将淀粉水解，产成的葡萄糖进一步水解后生成乙醇、乙醛、乙酸，然后继续与其他物质作用而形成酯类；而脂肪经脂肪酶水解后生成的脂肪酸与甘油结合而形成低分子酯类，脂肪酸还可以与醇类物质进一步作用，这为有机酸、醛类、酮类、烃类等发酵豆制品的芳香类化合形成提供机会[34]。此外，1-石竹烯的形成可能与葡萄糖苷酶活性有关[35]，其香气很特别且明显。

本研究发现，发酵过程中黑豆丹贝的氨基酸态氮、水解度、10 kDa 以下肽含量整体变化趋势一致，即在发酵0～15 h 变化幅度较小，发酵15 ～39 h 迅速升高，发酵39 h 达到最大值；麦角固醇含量呈先上升后下降的趋势，在发酵33 h 达到最大值。说明随着发酵时间的延长，少孢根霉生长状况良好，并利用自身分泌的蛋白酶将蛋白质水解成为多肽、小肽或游离氨基酸等物质，这些物质不仅赋予丹贝丰富的风味，还提高了黑豆丹贝的营养，有利于人体的消化吸收[23，25]。同时，发酵后黑豆丹贝的总酚、总黄酮和原花青素含量分别是未发酵样品的2.59、2.12 和4.04 倍(P＜0.05)，且均与抗氧化活性密切相关(P＜0.05)。虽然植物中含有大量的酚类物质，但主要以共轭形式存在，这导致其活性羟基减少，从而抑制了抗氧化活性[36]。微生物代谢产生的β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和蛋白酶等水解酶类可促进酚类物质由结合态转化为游离态[37]。而游离多酚、黄酮和原花青素含量的增加，则往往伴随着抗氧化活性的增强[25，38-39]。因此，微生物发酵可以作为提升产品抗氧化活性的一种有效途径[36]。

4 结论

本研究结果表明，发酵后黑豆丹贝的水分含量显著降低，粗蛋白含量显著增加，共检出24 种香气物质，较未发酵样品多14 种，且发酵后样品新检出醛类、烃类和酯类三类香气物质；发酵结束后的黑豆丹贝蛋白质水解度以及麦角固醇、氨基酸态氮、10 kDa 以下肽、总酚、总黄酮、原花青素含量均较未发酵样品显著增加，且酚类物质含量与抗氧化活性呈显著正相关。综上，少孢根霉发酵对黑豆丹贝产品香气有积极影响，且发酵后产品的主要成分和抗氧化水平获得显著改善。因此，利用少孢根霉发酵是生产黑豆丹贝产品的一条新途径。但目前对黑豆丹贝的研究尚浅，应进一步探究黑豆丹贝发酵中的生化动态、生物活性及其产品的生理功能，以期为黑豆丹贝的深度开发提供依据。