sRNA的研究概述及其在小麦赤霉病防治中的应用展望

孙政玺，胡思嘉，周益雷，胡怡，江宁，李磊，李韬

扬州大学农学院，教育部植物功能基因组学重点实验室；江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室；江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心；江苏省作物遗传生理重点实验室，江苏扬州225009

小麦赤霉病是严重危害小麦产量和品质的主要病害之一，由于该病害寄主抗性属于数量性状，表型鉴定困难以及小麦基因组复杂等特点，导致赤霉病抗性相关基因的克隆和遗传改良进展缓慢，难以从根本上防治病害的大面积爆发。目前的防控主要依赖于农药，然而农药的过量使用会造成环境污染，并且籽粒中的农药残留会对人的身体健康造成威胁。基于此，开发更加环保、高效的抗赤霉菌生物制剂具有重要的生产意义。近年来，关于小分子RNA参与植物/作物抗病机制的研究陆续被报道，sRNA具有分子量小、可移动、靶向更精准等特点，有利于开发成赤霉病防控生物制剂。本文综述了sRNA的研究进展以及在模式植物和作物中的应用现状，结合小麦赤霉病的特点，提出了如何利用sRNA进行赤霉病防治的策略。

1 植物小分子RNA的研究进展

小分子RNA首先在动物中被发现，在植物中也得到了广泛的研究。植物基因组能够产生大量不同类型的sRNA，根据sRNA的形成、成熟序列特征以及生物学功能等主要分为3类，即microRNA(miRNA)、short interfering RNA（siRNA）和tRNA derived fragment(tRF)。

1.1 miRNA研究进展

miRNA广泛分布于植物基因组中，作为真核生物基因表达转录后调控的一类负调控因子，在基因表达调控网络中发挥关键作用，参与调控植物生长发育、逆境响应等生理生化过程[1-3]。miRNA的前体序列由RNA聚合酶Ⅱ介导转录，形成大约1 kb的具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA序列，该序列经过DICER-LIKE1(DCL1)的剪切修饰后形成具有茎环结构的前体pre-miRNA(precursor miRNA)，pre-miRNA在HUA ENHANCER1(HEN1)及HYPONASTIC LEAVES1(HYL1)等蛋白的协助下经过DCL1进一步剪切修饰形成长度在21 bp左右的miRNA-miRNA*复合体，该复合体在植物中由HASTY蛋白转运至细胞核外，miRNA单链在细胞质中被组装进入RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)中行使基因沉默功能，而miRNA*一般认为被降解[4]。根据目前的研究，miRNA通过匹配靶基因的mRNA行使功能，并在匹配位置进行切割或者在翻译水平进行抑制[5]。

1.2 siRNA的类型及研究进展

siRNA在植物中比miRNA发现得更早，与miRNA在合成上的区别主要表现在：siRNA的前体是长的双链RNA(dsRNA)，而miRNA前体是单链mRNA形成的茎环结构。siRNA的双链前体由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases,RDRPs)途径 形成[6]。miRNA主要来源于植物自身基因组，其表达受到植物的发育阶段或者环境因素调控，但是siRNA大部分来自植物外部，如病毒来源或者转基因过量表达的mRNA通过逆转录形成dsRNA，也有siRNA来源于植物基因组。miRNA也可以介导siRNA的形成，主要是被miRNA降解的靶基因再经过RDRPs加工形成，如miR173介导TAS基因形成的ta-siRNA(trans-acting siRNA)[7]。除了ta-siRNA，还有3类siRNA，分别是nat-siRNA(natural antisense transcripts-derived siRNAs),hc-siRNA/ra-siRNA(heterochromatic siRNA/repeat-associate siRNA)和lsiRNA(long siRNA)。

nat-siRNA主要是由反义转录本和正义转录本的重合区形成的dsRNA，进而通过DCL1/DCL2、HYL1和HEN1以及RDRP6途径相关酶共同作用形成的siRNA[8]。hc-siRNA/ra-siRNA主要产生于基因组上的转座子、重复元件和异染色质区域，该类siRNA的合成依赖于DLC3-RDRP2-PolIV途径[9-11]。从命名便可以区分lsiRNA和其他siRNA，lsiRNA长度在30～40 nt之间，合成途径依赖于DCL1、HYL1、HEN1、AGO7和HST，也有依赖于RDRP6-PolIV途径[12]。不同类型的siRNA，成熟序列的长度也有差异。一般而言，由DCL1和DCL4参与形成的siRNA长度是21 nt，如ta-siRNA和nat-siRNA（包括miRNA）；DCL3切割dsRNA形成的siRNA长度主要是24 nt，如hc-siRNA/ra-siRNA；DCL2一般参与形成22 nt的siRNA[13-14]，部分nat-siRNA的长度也是22 nt。

siRNA成熟序列的长度和miRNA很相近，部分siRNA的作用方式与miRNA相似，主要通过序列特异性识别的方式沉默靶基因。但是siRNA与miRNA在功能方面仍然有不同之处，miRNA如果能够与靶基因完全匹配，则可造成靶基因mRNA的降解，如果不完全匹配，也可造成靶基因的降解或者翻译抑制。siRNA是以碱基完全互补配对的方式和靶基因结合，造成的后果主要是mRNA的降解。siRNA也有完全不同于miRNA的调控方式，如hc-siRNA/ra-siRNA，该类siRNA发挥功能主要是通过识别DNA上的靶位点介导DNA甲基化或组氨酸修饰，即RNA依赖的DNA甲基化（RNA-dependent DNA methylation，RdDM)[15]。

1.3 tRF研究进展

tRF最早也是在动物中被发现的一类新型的sRNA，由tRNA的前体或者成熟tRNA被相应的剪切酶加工形成小分子片段，根据长度可分为：长tRF（约30～35 nt）、短tRF（介于17～28 nt）和微小tRF(约10～16 nt)[16]。长tRF主要由tRNA反密码子区的序列形成，短tRF由tRNA序列上的D环和T环结构的序列形成[17]。长tRF主要是由核糖核酸酶加工而成，人类中是核糖核酸酶A[18]，在酵母和原生生物中是核糖核酸酶T2家族成员Rny1p和Rnt2[19-20]；短tRF主要是由DICER1或者DICER1类似蛋白的DCL1加工而成[21-23]，但是在植物中形成tRF的酶主要是核糖核酸酶T2家族成员[24]。研究发现tRF发挥功能的方式与miRNA的功能方式相似，也通过和AGO蛋白组装形成基因沉默复合体（RISC）对靶基因进行转录后抑制[21,25-26]。这些tRF参与调节一系列的细胞活动[27]，尤其在癌症、代谢性疾病等方面研究比较深入[28-30]。随着高通量测序技术的发展，植物中目前已经在拟南芥、水稻、大豆、玉米、苜蓿、高粱以及葡萄中鉴定到大量tRFs[16,31-32]，但是关于tRF功能研究的报道仍然很少，仅在大豆固氮结瘤过程中被发现可以从根瘤菌中跨界转移到大豆根部调控根瘤的发育[33]，小麦中目前还没有关于tRF的报道。

2 sRNA在作物抗病中的研究进展

2.1 sRNA在模式植物和作物中的抗病功能

作物病害根据致病微生物的种类主要分为病毒病、细菌性病害和真菌性病害。植物在长期进化以及和病原微生物的互作过程中形成了相对成熟的免疫系统，如PAMP（pathogen-associated molecular pattern）触发的PTI（PAMP-triggered immunity）反应和ETI（effector triggered immunity）反应。关于这两类植物免疫反应的研究主要集中在一些识别受体的发现及其触发的一系列程序性应答机制，如PRR（plasma-membrane-associated pattern recognition receptors）和NLR[nucleotide binding domain,leucine-rich repeat(LRR)domain-containing receptor]基因[34]。这两类免疫应答机制在植物响应细菌性病害的应答过程中作为基础应答反应发挥着重要作用，而对于病毒病和真菌性病害，这两种免疫应答机制也发挥着一定作用，但是植物对于病毒病和真菌病害分别进化出了不同于细菌性病害的抗性机制，而且作物中的大部分病害是病毒病和真菌性病害。近十来年的研究发现，受病原微生物诱导，植物除了启动免疫应答反应之外，sRNA也参与调控作物的抗病反应[35]。sRNA由于其分子量小、可移动的特点[36]，可异位调控基因转录后水平。关于sRNA在菌植互作过程中的功能主要分为三个方面：一是作物内源sRNA调控作物自身的靶基因，二是作物sRNA跨界调控病原微生物的基因，实现对病原菌入侵的抑制，三是病原微生物的siRNA跨界调控作物的基因而抑制作物的抗病能力，进而实现顺利入侵。植物中第一个被报道参与调控植物抗病免疫反应的miRNA是miR393，其通过减弱生长素信号通路而激活PTI反应[37]。植物中第一个被报道调控抗病反应的siRNA是nat-siRNAATGB2，该siRNA沉默了植物防御反应的一个负调控因子，促进ETI反应[8]。AtsiRNA-1是目前发现的唯一的在植物防御中具有功能的lsiRNA，其通过沉默一个植物防御的抑制因子RAP而促进植物的ETI反应[12]。随后也陆续发现多个参与植物抗病过程的miRNA和siRNA，如miR863-3p[38]、miR472[39]、miR482/miR2118[40]、nat-siRNA6019[41]等，但是这些sRNA都是在植物受到病毒或者原核细菌入侵所诱导的。在真菌性病害的研究方面，以作物居多，主要在水稻中的研究比较深入，比如过表达miR160和miR398可以增强水稻对稻瘟病的抗性，二者分别通过抑制各自的靶基因ARF16和SOD2发挥功能[42]。棉花在无黄萎病菌入侵的情况下，miR482可以通过直接切割NBS-LRR的mRNA进一步形成次级siRNA，加强对NBS-LRR基因的抑制，当受到黄萎病菌的入侵后，miR482被抑制，其靶基因NBS-LRR被上调，从而增强棉花对黄萎病的抵抗能力[43]。miR156作为调控发育的明星miRNA，也被发现能够调控水稻对稻瘟病的抗性，主要通过精细调控其靶基因OsSPL7实现抗病和产量的精准平衡[44]。在小麦白粉病的研究中发现TamiR159a、TamiR164a、TamiR167a、TamiR171a、TamiR444、TamiR408、TamiR1129和TamiR1138响应白粉病，可能主要通过其靶基因调控赤霉素、脱落酸、生长素和蛋白合成途径应答白粉病菌的入侵[45]。在小麦条锈病的研究中也发现特异响应锈菌入侵的sRNA，比 如Pst-miR163、Pst-miR118、Pst-sir9和Pst-sir110[46]。

2.2 sRNA的跨界抗病功能

近些年的研究也发现，除了作物内源的sRNA通过调控自身靶基因进而对作物的抗病能力实现精细调控外，sRNA还可以通过跨界的方式调控植物的抗病能力。棉花中两个重要的miRNA——miR166和miR159，被发现可以通过跨界到黄萎病菌中分别作用于病原菌的基因VdClp-1和VdHiC-15，降低病原菌的毒性[47]。宿主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）是最早在植物病毒病中发现并提出的植物利用sRNA抵抗病毒入侵的机制，其基本原理是植物在识别了病毒的mRNA以后，通过反转录的方式形成dsRNA，然后在DICER酶的作用下形成小分子dsRNA，由此衍生的siRNA通过与AGO蛋白形成复合体，并对其来源的病毒mRNA进行沉默抑制[48]。目前该技术不仅应用于农作物防治病毒病，也被应用于防治不同病原菌造成的病害以及昆虫、线虫等虫害[49]，主要通过利用转基因的方法，针对病毒、病原菌和昆虫关键基因设计表达载体，由植物体产生dsRNA，通过囊泡运输至病原菌体内或者被昆虫口器吸收后对靶基因进行抑制，从而实现作物对病虫害的抗性。由此衍生而来的VIGS（virus-induced gene silencing）技术可用于研究作物基因功能[50]。除了作物可以向病原菌中转运sRNA，病原菌同样可以向作物中转运sRNA，靶向抑制抗病基因的功能，利于病原菌的入侵[51-53]，来自于小麦条锈病菌的Pst-milR1通过跨界抑制小麦PR-2基因，破坏小麦对锈菌入侵的抵抗能力[51]。目前tRF虽然在作物中也有报道，但是在病原菌-植物互作过程中的研究还很少，仅在大豆中发现根瘤菌中的tRF可以通过跨界调控大豆根部结瘤相关基因控制结根瘤的形成和发育[33]，在作物与病原菌的互作中还未有报道。

3 sRNA在小麦赤霉病抗病机制中的研究进展

由于小麦是六倍体作物，基因组庞大，基因组测序完成较晚，因此在sRNA鉴定及功能方面的研究迟滞于其他作物。目前关于小麦sRNA的研究很有限，大多数研究主要利用高通量测序技术对小麦sRNA进行鉴定或者利用同源克隆的方法进行功能研究[54-56]。

小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌引起的真菌性病害，赤霉菌会入侵小麦根部、茎基部和穗部从而造成根腐、茎基腐以及穗腐。除此之外，穗部被赤霉菌入侵后，还会造成籽粒内积累大量脱氧雪腐镰刀烯醇毒素DON，进而使小麦大幅减产或籽粒毒素超标，严重威胁粮食和食品安全。由于小麦赤霉病表型鉴定困难以及小麦基因组复杂等诸多因素导致与赤霉病抗性相关基因的克隆和遗传改良进展缓慢，虽然目前已经通过图位克隆的方法克隆到调控赤霉病的主效基因PFT、HRC/HIS和Fhb7，但是基因功能及调控机制或未解析或仍存有争议[57-60]。基于赤霉病的复杂性，也有学者从sRNA的角度做了初步的探索。通过接种赤霉菌，利用sRNA高通量测序方法发现小麦特异miRNA tae-miR9670、tae-miR9655、tae-miR9657和tae-miR9676受赤霉菌的诱导，并通过抑制小麦自身靶基因调节小麦对赤霉病的响应[61]，但是这些miRNAs和靶基因是否在赤霉病响应过程中具有明确的生物学功能还缺乏证据。在跨界调控方面，Jiao等[62]发现小麦miR1023跨界抑制赤霉菌的靶基因FGSG_03101可以抑制赤霉菌的入侵进程，但是该研究是利用叶片进行表型分析，而且是通过VIGS方法进行功能验证而非稳定转基因的功能验证，因此该miRNA是否在穗部组织具有抗赤霉病作用，还有待深入研究。sRNA不仅可以从小麦跨界到赤霉菌，也可以反向跨界，如赤霉菌的Fg-sRNA1可跨界到小麦中抑制其靶基因Ta-CEBiP，促进赤霉菌对小麦的入侵[63]。tRF目前在小麦赤霉病方面的研究依然是空白。

4 利用sRNA防治赤霉病的应用探讨

目前赤霉病的防治主要还是依赖于化学农药的使用，见效快、成本低，但是农药残留会威胁食品安全，并且造成环境污染，此外，农药的使用会促使赤霉菌的耐药性产生变异，因此并不是根治赤霉病的最佳途径。抗性品种的选育可以从根本上解决赤霉病的危害，但是选育时间长，且目前克隆的抗病基因都存在争议。虽然分子标记的使用可以加快抗病品种的育成速度，但是要实现丰产与抗病有效结合，难度依然很大。因此，开发环保的生物药剂通过外施来抑制赤霉菌的生长在理论上是比较有效而且环保的防治途径。基于sRNA分子量小、可移动的特点[36]，有学者已经开始尝试使用sRNA进行赤霉病的生物防治[64-65]。若要将sRNA作为一种高效的防治物投入到农业生产应该考虑到以下几个问题：第一，HIGS是目前已经初步被证实具有抵制病原微生物的新机制，可以在赤霉菌中鉴定更多的靶标并进行转基因材料的创建，但是目前转基因材料仍然不能被市场完全认可和接受，可以先通过功能研究，储备基因资源。第二，有研究发现miRNA的前体可以编码小肽，并且发挥与相应miRNA相同的功能[66]，因此可以通过利用多组学的方法，挖掘抗病相关的小肽，对其抗病功能进行验证，如有效果明显的，可以通过合成的方法制备抗病制剂。第三，要鉴定或设计出抑制赤霉菌生长发育关键基因的sRNA，并且外施该sRNA对小麦自身基因无抑制作用，不影响小麦的生长发育和籽粒成熟。tRF作为一类新型sRNA，有必要深入研究其在小麦赤霉病防治上的功能并加以利用；第四，sRNA的跨界效率，即sRNA在自然条件下能够尽快进入赤霉菌发挥作用，因此，sRNA的运输载体很重要，比如可以使用纳米材料包裹sRNA（类似囊泡运输的机制），当然，需要同时考虑纳米材料使用的环保问题；第五，sRNA的合成成本问题，若要被广大农民接受，成本是关键的因素，需要筛选更加廉价的合成原料和运输载体。总之，利用sRNA防治赤霉病是一种潜在的防治策略，但是相关的理论研究尚有待深入。