细菌反式翻译系统

刘超伦， 刘柱

海南大学生命科学学院，海口571158

细菌中通常不存在真核生物类似的mRNA保护机制[1]，形成不具有终止密码子的mRNA（non-stop mRNA），无法保证mRNA 转录的精确与完整。不终止mRNA 产生的方式多种多样，包括过早的转录终止、核酸酶的切割以及物理损伤等。此外，终止密码子的通读[2]、药物诱导的移码和密码子错配[3]，以及mRNA 转换过程中RNase 的杂散活性[4]，也会导致不终止mRNA 的产生。当核糖体遭遇连续的稀有密码子[5]、弱的终止密码子[6]，或者产生问题多肽时[7]，翻译会在中途发生停滞，此时RNaseⅡ或多核苷酸磷酸化酶会沿着3'→5'的方向降解mRNA，并在核糖体A位点进行切割[8]，核糖体到达不终止mRNA 的3'端时，mRNA 终止于核糖体的P 位点而A 位点处于空载，翻译不能继续延伸或进入终止阶段，导致核糖体滞留在mRNA 上，形成不终止核糖体复合物（non-stop ribosome complexes）。在大肠杆菌中，不终止核糖体复合物的产生频率占新合成肽链的2%～4%[9]。该复合物空耗细胞中的核糖体和tRNA，同时产生截短的、具有细胞毒性的异常多肽，严重损害核糖体的循环、蛋白质合成以及细胞的进一步生长和活力[10-11]。

为了回收滞留的核糖体，降解不终止mRNA及其编码的异常蛋白质产物，细菌进化出多种核糖体拯救机制，包括tmRNA 与SmpB 介导反式翻译，ArfA 与ArfB 介导的拯救机制（alternative ribosome rescue factors，Arfs），以及核糖体质量控制（bacterial ribosome quality control，RQC）与肽基tRNA 脱落（peptidyl-tRNA drop-off）等[12-13]。其中，反式翻译是拯救不终止核糖体复合物最普遍、最有效的途径。与其他核糖体拯救机制相比，反式翻译的优势在于能够降解异常的多肽与mRNA[14]。在一些生物中，反式翻译系统是必不可少的[15-17]。反式翻译由tmRNA（又称ssrA）及其蛋白伴侣SmpB 组成，在细菌中普遍存在，甚至在一些细胞器中也有发现[14,18]。tmRNA 自1979 年在大肠杆菌中被发现，其结构与功能已逐渐被阐释清楚。tmRNA 既有tRNA 样结构域（tRNA-like domain，TLD），又有mRNA 样结构域（mRNA-like domain,MLD），氨酰化tmRNA 与SmpB 结合后，在延伸因子EF-Tu 的辅助下与滞留核糖体中空的A 位点结合，恢复翻译并给新生肽添加降解标签，最终回收滞留的核糖体，并降解不终止mRNA 及其编码的异常蛋白[19-20]。

1 tmRNA-SmpB 介导反式翻译系统的结构基础

1.1 tmRNA的结构

在大肠杆菌中，成熟的363 nt tmRNA 是由457 nt ssrA RNA 前体加工而来。tmRNA 主体为4个假节（pseudoknot）与MLD 组成的巨大环状结构，TLD 通过螺旋H2 结构域与假节相连。成熟tmRNA 的3'末端与5'末端会形成一个受体臂，具有tRNA 中高度保守的CCA 序列，但只能被丙氨酸氨酰化[19]。受体臂附近还存在类似tRNA 的T臂（T stem-loop）与缺乏茎的D 环(D-loop)，tmRNA与SmpB 的结合和功能发挥需要这两个环之间的特定相互作用[21]。此外，T 臂转录后修饰会使得上述相互作用得到增强[22]。

MLD 中包含了一个短的开放阅读框，其终止密码子位于保守的H5 螺旋中。该阅读框可以编码一个被ClpXP 识别的降解标签，通常为10 个残基[23]。与mRNA 相比，MLD 的阅读框没有起始密码子[24]。在大肠杆菌中标签肽的序列为“AANDENYALAA”，而在维氏气单胞菌中则为“ANDENYALAA”，标签肽末端的 Ala-Ala-coo-是ClpXP 降解的最重要位点[25]。

经典 tmRNA 分子包含 4 个假节，PK1 位于MLD 上游，PK2～PK4 位于下游。在大肠杆菌中，tmRNA 对反式翻译底物添加标签主要受PK1 的影响，其他假节的替换对于tmNRA 的功能影响不大[26]。而当PK1 被小而稳定的RNA 发夹替代时，tmRNA 仍然能够给底物添加标签，这说明PK1 并不直接参与tmRNA 与核糖体的互作，而是稳定了TLD 和 MLD 之间 的构象 ，防止 tmRNA 错 误折叠[27]。在一些细菌中，存在由两条RNA 链组成的tmRNA（two-piece tmRNAs），其假节数量较少但翻译效率并没有降低，这说明PK2、PK3 和PK4 的主要作用是tmRNA 的折叠和成熟，而不是参与反式翻译[28-29]。

1.2 SmpB的结构

SmpB 是反式翻译必不可少的RNA 伴侣蛋白，在所有细菌中高度保守。SmpB蛋白具有一个寡核苷酸结合折叠结构（oligonucleotide-binding fold），核心由一个封闭的桶状结构组成[30]。该桶中有 8 条反向平行的 β 链，周围环绕着 3 个 α 螺旋，而第64～82 个氨基酸残基形成了一个中心环并与链β4 和β5 相连。SmpB 结构与已知的与翻译相关的RNA 结合蛋白IF1、核糖体蛋白S17 以及天冬氨酰tRNA 合成酶的N 末端结构域具有相似性[31]。 SmpB 蛋白 Arg-35、Phe-107 和 Val-31 的侧链扮演着tRNA 中D 臂的角色，与tmRNA 的TLD 特异性结合；中心环则参与了与丙氨酸tRNA合成酶的相互作用，促进tmRNA 与丙氨酸发生氨酰化反应[32]。除了核心结构外，SmpB 蛋白还存在一个独立的C 末端尾巴，尾巴中富集了侧链带正电荷的赖氨酸与精氨酸残基。SmpB 的C 末端尾巴在溶液中无序卷曲，在核糖体中却能形成一个α 螺旋结构；该螺旋可以通过正电荷进入核糖体30S 亚基 mRNA 通道中的 A 位点，帮助 tm-RNA-SmpB 复合物进入滞留的核糖体并支持肽基转移[33]。

2 tmRNA-SmpB 介导的反式翻译的分子机制

核糖体长时间的翻译停滞会使得mRNA在核糖体的A 位点附近发生核酸内切酶内切[6]，随后tmRNA 在丙氨酰-tRNA 合成酶的作用下装载丙氨酸，并与EF-Tu 和SmpB 蛋白结合，进入核糖体的A 位点[34]。tmRNA·SmpB·EF-Tu·GTP 四元复合物中TLD 和SmpB 的构象类似于解码期间的氨酰基-tRNA·EF-Tu·GTP 的 A/T 状态[35]。SmpB 通过 C末端尾巴的带电残基与mRNA 通道互作并将SmpB 固定在A 位点，取代了密码子-反密码子相互作用并结合在核糖体的解码中心和mRNA通道上。此时tmRNA 的受体臂与正常翻译过程中酰化的tRNA 受体臂类似，PK2 的环被夹在uS3 的螺旋-转-螺旋基序的口袋中，与核糖体蛋白uS3 互作并将tmRNA 锚定到小亚基；H5 则堵塞mRNA通道的入口并紧靠SmpB 的尾巴，其磷酸酯主链与 uS3 的 Arg132 和 Arg143 发生静电相互作用[35]。值得注意的是，当滞留核糖体复合物中P 位点下游的核苷酸数量大于9 时，过长的mRNA 会与核糖体mRNA通道入口的H5发生碰撞，反式翻译的效果会显著降低，这说明PK2和H5与核糖体的结合可能在滞留核糖体的识别中发挥作用[35-36]。

进入核糖体之后，tmRNA 很容易从EF-Tu 中释放出来[20]。肽基转移之前，tmRNA-SmpB 复合物需要发生两个构象变化[35]：SmpB 的C 末端尾巴通过高度保守的Gly132 发生弯曲，允许SmpB 主体进入 A 位点；tmRNA 的 D 环与 16S rRNA H38 互作，TLD 的3'-CCA 末端进入肽基转移中心（peptidyl transfer center，PTC）。转肽后，新生肽被一个丙氨酸延长, 阅读框从mRNA 转换到tmRNA 的MLD 上[37]。因而转肽过程中，MLD 必须穿过由16S rRNA H34 与 G530 组成的物理“门闩”，以加载到 mRNA 通道中[35]。此时，SmpB 的 C 末端尾巴保持α 螺旋，而高度保守的Gly132 则再次充当SmpB 蛋白主体与尾巴之间的柔性关节，促进C 末端尾巴翻转进而与E 位点的mRNA 通道结合，腾空A位点，并将tmRNA-SmpB 锚定在P位点[35]。由于位于mNRA 通道入口的SmpB 和隶属于tmRNA的H5 发生了移动，不再堵塞mNRA 通道的入口，MLD 得以通过 A 位点的“门闩”。MLD 加载到mRNA 通道后，还需要保证MLD 内的阅读框能够正确定位，确保核糖体终止于阅读框内的终止密码子。点突变与Cryo-EM 研究表明，MLD 编码区第一个密码子（恢复密码子）的前五个核苷酸，对于MLD 与阅读框在核糖体中的准确定位十分关键[35,38-39]。恢复密码子上游区域能够与SmpB 蛋白底部的疏水口袋及其C 末端尾巴互作，这些互作将恢复密码子直接定位在核糖体30S 解码中心[40-41]。

Ala-tRNAAla与MLD 上的恢复密码子结合后，EF-G 将肽 基-tRNAAla转 移到 P 位点 ，迫 使 tm-RNA-SmpB 趋向 E 位点；此时 tmRNA-SmpB 复合物不会模拟结合在E 位点的tRNA，而是通过E 位点移至核糖体的溶剂侧。这是因为TLD-SmpB 复合体会与E 位点的核糖体发生碰撞，而MLD 依旧能够通过 E 位点由 uS7、uS11 以及 16S rRNA G693组成的“门闩”，并被完全加载到mRNA 通道中[35]。随后，翻译将在MLD 的阅读框上进行，并将标签肽添加到新生的多肽链上，在终止密码子进入A位点后翻译终止并进行核糖体回收。

反式翻译添加到新生多肽上的标签能够被多个蛋白酶识别，例如ClpXP、ClpAP 和Lon，它们促进了异常多肽的降解[42-43]。ClpX 采用一种独特的机制识别tmRNA 的降解标签，其AAA+环的轴向通道被A 亚基的pore-2 loop 所封闭，特异性地与tmRNA 标签肽的C 末端互作[44]。与新生肽降解一致，引起核糖体滞留的不终止mRNA 也会被tm-RNA MLD 的 3'端招募的 3'→5'核酸外切酶RNase R所降解[45]。

3 tmRNA与SmpB以多种方式发挥功能

反式翻译在所有已测序的细菌基因组中都是保守的，对于细菌的存活十分重要[17,46]。在一些病原菌中,例如金黄色葡萄球菌、李斯特菌或结核分枝杆菌，反式翻译是细胞存活的必须条件[47-49]。而在含有多种核糖体拯救机制的细菌中，反式翻译的失活带来的影响千差万别：有些菌株会产生毒力缺陷[50-53]，有些菌株的耐药性和抗逆能力会受到影响[54-56]，还有些细菌的细胞周期会发生改变[57-59]。

反式翻译的主要功能为翻译质量控制。前文详细描述了反式翻译拯救滞留的核糖体的分子机制，反式翻译最直接的功能是将不终止核糖体复合物中的核糖体、异常mRNA 及其编码的异常蛋白在处理后回收，并应用于新的翻译循环。除此之外，tmRNA 与SmpB 还能够根据蛋白质折叠与分泌水平介导翻译质量控制。例如，当dnaK敲除时，错误折叠的新生多肽会成为反式翻译的靶标并被迅速降解[51]。而当SecYEG 介导的共翻译转运被氯霉素或四环素抑制导致SecYEG 被堵塞时，反式翻译通过释放核糖体恢复SecYEG 的分泌功能，避免SecY降解[60]。

除了翻译质量控制外，tmRNA 与SmpB 还以反式翻译的形式参与细菌的调控网络。反式翻译可以直接调控某些基因的表达，例如阻遏蛋白LacI。当LacI 的浓度过高时，LacI 会结合在自身基因的3'端从而阻断自身的转录，通过产生不终止mRNA 诱导核糖体滞留，从而阻止新的LacI 合成，防止过量的蛋白积累[61]。目前，通过将tmRNA的标签肽突变为抗体标签，许多受到反式翻译调控的特异性底物已经得到了鉴定[62-64]。另一方面，反式翻译系统还会通过间接的方式参与细菌的应激反应。例如在饥饿状态下，毒素-抗毒素系统的RelE 将会被激活，切割胞内的mRNA 从而大量诱导不终止翻译复合物的产生，减少细胞能量的消耗以应对饥饿；而当营养恢复时，细菌利用反式翻译系统拯救滞留的核糖体并恢复生长[65]。MazF 的机制也类似，通过诱导滞留核糖体的产生使得细菌在逆境中更耐受[66]。

值得注意的是，尽管tmRNA 与SmpB 对于反式翻译来说是缺一不可的，但二者也可能以不依赖于反式翻译的方式发挥功能。例如，在金黄色葡萄球菌中tmRNA 可以发挥sRNA 的功能，与crt-MNmRNA 的RBS 区发生碱基配对，调控金黄色葡萄球菌的色素合成[67]。而在维氏气单胞菌中，敲除SmpB 与敲除tmRNA 在转录和代谢水平上的差异也间接证明二者可能具有独立作用[68]。遗憾的是，作为RNA 伴侣蛋白的SmpB 目前还尚未被报道具有不依赖反式翻译的功能。

4 展望

经过数十年的研究，反式翻译模型已经基本建立，关于反式翻译识别和回收不终止核糖体复合物的分子机制已有足够的阐述，为反式翻译的应用提供了扎实的理论基础。基于对反式翻译机制的深刻理解，开发以反式翻译为基础，调控细菌蛋白水平的分子生物学工具是反式翻译应用的重要方向。在研究基因功能与细菌代谢通路的过程中，无论是通过诱导型启动子或sRNA 等方式来控制基因的转录水平，还是通过核糖体开关或mRNA 降解对基因进行翻译水平上的调控，均只能阻止基因表达合成新的蛋白，而对已经合成的蛋白无能为力。对于稳定的蛋白质，可能需要多轮复制才能将其在胞内的数量和活性降低到足够低的水平，而在此期间可能会大大影响基因表达调控的有效性。因此，将能够降解特定带标签蛋白的反式翻译系统开发成新的分子生物学工具，具有难以替代的重要意义。近年来，人们已经在细菌中应用了一些基于反式翻译系统的遗传工具。Mc Ginness 等[69]将 tmRNA 标签的最后 3 个残基LAA突变为DAS并插入了4个额外的氨基酸残基，使得ClpXP 只有在SspB 存在的情况下才能对标记底物进行彻底降解。该系统已经被成功应用于大肠杆菌、芽孢杆菌与分歧杆菌之中，并且进行了进一步改进以确保降解的精确与彻底[70-73]。然而，上述系统依赖于SspB与大肠杆菌的tmRNA标签序列，限制了其在不同细菌中的应用。如何提高反式翻译系统作为遗传工具的使用范围并探究其中的具体机制，将是后续研究需要解决的主要问题。

由于反式翻译在细菌中普遍存在并且起关键作用，反式翻译抑制剂有极大可能是有效的广谱抗生素；此外，由于在动物中没有发现反式翻译途径，反式翻译抑制剂将不会对宿主带来副作用。因而，反式翻译日渐成为了抗生素开发的重要靶标。反式翻译抑制剂KKL-35 的发现证明了上述观点：在反式翻译中阻碍tmRNA 给新生肽添加降解标签的KKL-35，在抑菌实验中展现了广谱抗菌活性，能够杀死结核分枝杆菌并有效抑制弗氏志贺菌和炭疽芽孢杆菌的生长[74]。后续KKL-2098、KKL-40、KKL-55、吡嗪酰胺（PZA）等反式翻译抑制剂的研究证实反式翻译在医疗领域具有极高的应用潜力[75-78]。在全球范围细菌耐药性不断增加、超级细菌不断产生的大环境下，反式翻译应被视为未来进一步开发抗生素的主要靶标。