叶酸对蛋氨酸负荷的去势大鼠主动脉病变保护作用研究

田盼丽，尚 涛，李红梅

绝经后血浆同型半胱氨酸(Hcy)的水平显著上升，高同型半胱氨酸血症(HHcy)是近年来新发现的一个重要的、独立的心血管疾病危险因素，可引起动脉粥样硬化病变[1-2],但其具体的致病机制尚未完全明了。本研究探讨HHcy是否能通过诱发脂代谢紊乱及血管的炎性反应而发挥致动脉粥样硬化作用效应，以及叶酸治疗是否具有保护作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料：健康4月龄雌性SD大鼠32只，体重(240±20)g，购自兰州大学医学院，随机分为4组：假手术组(SHAM组)、去卵巢组(OVX组)、蛋氨酸组(MET组)、叶酸治疗组(FA组)，各8例。材料：①同型半胱氨酸ELISA试剂盒：上海玉博生物科技有限公司产品，批号：CSB-E08896r；②NF-κB p65单克隆抗体(大鼠)：中山生物工程有限公司产品；③MCP-1单克隆抗体(大鼠)：武汉博士德生物工程有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：各组实验大鼠在无菌条件下行戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔注射麻醉后，取下腹正中切口，切除双侧卵巢，结扎输卵管及伴行血管，冲洗闭合伤口。其余8只不切除卵巢，只切除相同大小的卵巢周围脂肪组织，作为假手术组。

1.2.2 处理方法：①MET组：去卵巢术后1周给予蛋氨酸1 g/(kg·d)灌胃;②FA组：去卵巢+蛋氨酸灌胃+叶酸20 mg/(kg·d)腹腔注射，术后1周SHAM、OVX组灌服蒸馏水，其余各组开始蛋氨酸灌胃，且FA组同时药物干预，共持续9周。实验期间所有大鼠置同一室内，自由饮水，进食普通饲料，每周称重1次，依体重变化调整给药剂量。

1.2.3 血清Hcy测定:所有动物术后10周腹主动脉穿刺取血，分离血清，-20 ℃保存，采用ELISA法测定。检测方法按照试剂盒说明进行。

1.2.4 血脂测定:通过生化分析仪测定血清标本的血脂水平，主要包括TC、TG、LDL-C、HDL-C。

1.2.5 主动脉形态学观察:所有动物取血后处死，迅速剖取主动脉，将其置于4%多聚甲醛液中常规固定、石蜡包埋，轮转式切片机切成厚度为5 μm的组织切片，HE染色，光镜观察主动脉形态学改变。

1.2.6 主动脉NF-κB、MCP-1免疫组化染色:标本经3% H2O2处理，山羊血清在室温下封闭20 min，抗NF-κB、抗MCP-1抗体(稀释度1∶100)和生物素化羊抗兔IgG抗体依次反应和洗涤后，以DAB 染色试剂盒显色，苏木素复染核，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，切片置于显微镜下观察并照相。

1.2.7 结果判定及图像分析:细胞胞浆呈现棕色或棕黄色颗粒者为阳性，不显色者为阴性。采用彩色病理图文分析系统对免疫组化染色片进行半定量分析。

2 结果

2.1 各组大鼠血清Hcy水平比较：与假手术组组相比，去卵巢术后大鼠血清tHcy浓度明显升高(P<0.05)；给予蛋氨酸负荷，去势大鼠的血清tHcy浓度进一步升高(P<0.05)；叶酸治疗可显著降低血清tHcy浓度(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血清Hcy水平及主动脉NF-κB、MCP-1表达的比较

2.2 各组大鼠血脂水平比较：与SHAM组相比，OVX、MET组血清TC、LDL-C浓度明显升高(P<0.05)，HDL-C浓度降低(P<0.05，)；与MET组相比，FA组血清TC、LDL-C浓度均明显降低(P<0.05)，HDL-C浓度均明显升高(P<0.05)，接近SHAM组水平(P>0.05)；各组TG均差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的比较

2.3 HE染色结果:通过HE染色，在光镜可见假手术组主动脉内膜光滑完整，单层内皮细胞连接紧密，无脂质条纹或纤维斑块。去卵巢组主动脉内膜明显增厚，可见泡沫细胞，蛋氨酸负荷组内皮细胞广泛损伤，出现钙化坏死区。药物治疗组均不同程度地改善了血管的病理改变(图1-图4，目录后)。

2.4 主动脉NF-κB、MCP-1免疫组化结果：OVX、MET组大鼠主动脉组织NF-κB、MCP-1的表达较SHAM组明显升高(P<0.05)；MET组NF-κB、MCP-1的表达较OVX组进一步升高(P<0.05)；而叶酸治疗能减少蛋氨酸负荷去势大鼠诱导的HHcy所致的主动脉组织NF-κB、MCP-1的表达。

3 讨论

绝经后，除人们所熟知的激素水平的改变外，血浆同型半胱氨酸的水平也显著上升[1-2]，SHAONAN高奋[3-4]等实验均证明蛋氨酸负荷饮食亦可建立高同型半胱氨酸血症动物模型。去卵巢大鼠经蛋氨酸负荷后，蛋氨酸在体内可代谢为同型半胱氨酸而进一步加重高同型半胱氨酸血症(HHcy)[3]，HHcy是近年来新发现的一个重要的、独立的心血管疾病危险因素，可引起动脉粥样硬化病变[5-6]。本研究结果表明，OVX组大鼠血浆tHcy浓度较SHAM组升高，MET组血浆tHcy浓度较OVX组进一步升高，从而证明蛋氨酸负荷会加重去卵巢大鼠的高同型半胱氨酸血症，叶酸能显著降低OVX、MET组大鼠血浆tHcy水平。

众所周知，脂代谢异常是动脉粥样硬化和冠状动脉粥样硬化性心脏病的独立危险因素。高同型半胱氨酸血症影响血管内皮细胞胆固醇的代谢，使血管内皮细胞羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)mRNA和蛋白表达增强，引起脂代谢紊乱。高脂血症通过脂毒性损伤内皮细胞，受损的内皮细胞分泌趋化因子和黏附分子，如单核细胞趋化蛋白-1、E-选择素、细胞间黏附分子等来调节单核细胞黏附和迁移，单核细胞黏附于血管 EC 并进一步迁移进入血管壁，摄取脂质(OX-LDL、OX-VLDL)转化为泡沫细胞，泡沫细胞增加是AS形成早期的重要事件，在 AS 的形成中起关键作用。本实验结果表明，OVX、MET组血清TC、LDL-C明显升高，而HDL-C明显降低，经相关分析表明，OVX、MET组大鼠血清Hcy浓度与血清TC、LDL-C呈正相关(r=0.295、0.367，P<0.05)，说明高同型半胱氨酸血症可引起脂代谢紊乱，促进心血管损害发生。

炎性反应在动脉粥样硬化的发生发展中也发挥着重要的作用。外周血单核细胞迁入动脉内皮下间隙，分化为巨噬细胞是动脉粥样硬化的最早事件，而炎性细胞的召集、浸润主要由细胞趋化因子MCP-1调节。动脉组织可诱导表达NF-κB 和MCP-1，NF-κB是一种介导细胞信号传导的多效炎性核转录因子，可调控下游靶基因MCP-1的表达，MCP-1作为单核/巨噬细胞特异性的趋化因子，可引起单核/巨噬细胞在主动脉组织中广泛浸润，与泡沫细胞、粥样斑块的形成密切相关。目前，高浓度Hcy促进单核细胞浸润、巨噬细胞聚积主要是通过NF-κB途径诱导的MCP-1活化而实现的。本实验用免疫组织化学的方法检测大鼠主动脉组织NF-κB、MCP-1的表达，结果发现OVX、MET组大鼠主动脉NF-κB、MCP-1的表达均明显增多，即蛋氨酸负荷去势大鼠促进NF-κB、MCP-1的表达，且MCP-1随着NF-κB表达的增多而增多，亦说明NF-κB调控MCP-1的基因转录和表达。在动脉粥样硬化的发生发展中这种机制呈过度活化作用，并且这种调控作用本身可能参与了AS的发生和发展。

同型半胱氨酸是一种含硫非必需氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物。叶酸及其相关的辅酶因参与Hcy再甲基化生成蛋氨酸的代谢，被认为补充叶酸等B族维生素可降低血浆同型半胱氨酸水平[7-8]。Sharma M等[3]利用去卵巢大鼠模型，观察高同型半胱氨酸血症与心血管病的关系，及激素替代疗法和叶酸干预对心血管病的影响，结果发现，血清中低水平的叶酸含量与高水平的tHcy相关，单用叶酸或与激素替代疗法联合应用，对大鼠OVX组雌激素水平下降所致的相关症状产生保护作用。Cui R等[9]研究叶酸治疗显著降低大鼠血浆tHcy水平，叶酸可能通过下调趋化因子介导的炎症反应来阻止HHcy诱导的早期动脉粥样硬化的发生。本研究结果显示，蛋氨酸负荷的去卵巢大鼠给予叶酸干预治疗9周后，FA组血浆tHcy均显著低于MET组大鼠，但仍高于SHAM组和OVX组大鼠，这与叶酸参与同型半胱氨酸代谢有关。由此说明，叶酸干预治疗可降低蛋氨酸负荷去卵巢大鼠Hcy水平，从而减轻高同型半胱氨酸血症对心血管损害的影响，本研究结果与李刚[10]研究结论一致，说明叶酸辅助疗法能有效改善伴高Hcy血症高血压患者颈动脉硬化情况。

叶酸在显著降低血浆Hcy水平的同时，能不同程度地降低TC、LDL-C浓度，升高HDL-C浓度，改善脂代谢紊乱；本实验结果表明叶酸可抑制蛋氨酸负荷的去势大鼠主动脉NF-κB、MCP-1的表达，减轻HHcy引起的血管炎性损害。因此叶酸除了具有抗氧化及降低血浆Hcy水平外，其对细胞炎性因子表达的抑制证实其具有抗炎作用，这可能为临床治疗HHcy所致的动脉粥样硬化提供动物实验依据，并为动脉粥样硬化的防治提供了一个新思路。