HMGB1在膀胱尿路上皮癌中的表达及其对预后的意义

焦健华，焦 点，张景良，彭诗元，秦 军，杨力军，王映梅，马帅军，武 鹏，荆玉明，秦卫军

(中国人民解放军空军军医大学：1.西京医院泌尿外科，陕西西安 710032；2.唐都医院泌尿外科，陕西西安 710038;3.西京医院病理科,陕西西安 710032)

根据2018年全球癌症统计分析显示，全球每年有约55万新发膀胱癌患者，约20万患者死于膀胱癌[1]。其中男性发病率约为女性发病率的4倍，膀胱癌在男性新发恶性肿瘤中位居第6位，死亡率位于第9位[1]。膀胱尿路上皮癌(urothelial carcinoma of bladder，UCB)是最常见的膀胱癌类型，约占膀胱癌病例90.0%以上[2]。经尿道膀胱肿瘤切除术(transurethral resection of bladder tumor，TURBT)是膀胱癌的主要治疗手段[2]。目前患者的预后预测主要依靠肿瘤的数量、大小、分级、分期等临床病理因素，尚缺少有效预后标志物对患者进行预后分析。

高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)由HMGB1基因(13q12)编辑，是一种相对保守的非组蛋白染色体蛋白[3]。目前有研究表明，与正常组织相比，HMGB1在舌鳞状上皮癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌、脑胶质瘤等多种恶性肿瘤中表达显著增加[3-8]。由于在恶性肿瘤发生发展、新生血管形成、肿瘤免疫耐受等方面具有重要作用，近年来HMGB1成为恶性肿瘤研究的热点之一。本研究通过探讨HMGB1在UCB患者中表达情况，分析其与患者临床病理资料之间的联系，并探究其对预测UCB患者预后的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2007年6月至2015年6月在空军军医大学西京医院泌尿外科经手术切除并诊断为UCB的98例患者的临床病例资料，所有患者均有完善的临床资料、随访资料和保存完整的UCB组织蜡块标本。其中男性83例，女性15例；年龄26～86岁，平均(64±12)岁。根据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)膀胱癌TNM临床分期系统(2017版)显示：Ⅰ期49例，Ⅱ期23例，Ⅲ期24例，Ⅳ期2例。所有组织样本均采用4.0%中性缓冲甲醛固定液固定并进行常规石蜡包埋。

1.2 方法

1.2.1主要试剂 兔抗人单克隆抗体HMGB1(工作浓度1∶1 000，英国Abcam公司)；免疫组织化学检测试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司；小鼠抗人单克隆抗体Ki-67(工作浓度，即用型，福州迈新公司)。

1.2.2HE染色 所有组织蜡块切片后进行常规HE染色，石蜡切片厚度为4 μm。常规脱蜡水化，苏木素染色5 min，自来水清洗2 min，1.0%盐酸乙醇(体积分数)分化5 s，0.5%稀氨水(体积分数)反蓝5 s，伊红染色1 min，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明后使用中性树胶封片，在显微镜下由2名泌尿生殖病理专家进行观察及病理诊断。

1.2.3免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)染色 将石蜡切片进行常规脱蜡水化后，与煮沸的柠檬酸盐抗原修复液中加热修复2 min，自然冷却后使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)清洗5 min×3次，内源性过氧化物酶阻断剂(SP KIT-A3，福州迈新) 孵育30 min，PBS洗5 min×3次，正常非免疫山羊血清(SP KIT-B3，福州迈新)孵育60 min，HMGB1抗体按1∶1 000(体积分数)4 ℃孵育过夜，PBS洗5 min×3次，加入酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物(SP KIT-5030，福州迈新)孵育20 min，PBS洗5 min×3次，DAB显色(UltraDAB-4033，福州迈新)3 min，苏木素染核5 min，盐酸乙醇分化后使用稀氨水反蓝，并常规脱水透明后，中性树胶封片。每组IHC染色均设置阳性对照和阴性对照进行质量控制。

1.2.4染色判断标准 免疫组织化学染色的判断采用半定量方法进行。如图1所示，HMGB1的染色大多位于细胞核：根据细胞核染色细胞的比例对免疫组织化学评价，将细胞核染色阳性细胞比例>50.0%列为HMGB1高表达组，≤50.0%列为HMGB1低表达组。在计算染色细胞比例时，采用Image J软件辅助计算染色细胞比例并由2名具有10年以上泌尿生殖病理诊断经验的病理科专家进行评价。为进行生存分析比较，本研究将全部样本人群分成HMGB1高表达人群(细胞核染色阳性细胞比例>50.0%)和HMGB1低表达人群(细胞核染色阳性细胞比例≤50.0%)。

1.3 统计学分析采用SPSS 23.0统计软件，使用χ2检验进行率的比较，使用Kaplan-Meier曲线对HMGB1高表达和HMGB1低表达两组人群进行生存分析，对可能影响预后的因素进行单因素分析和多因素分析，使用Cox回归分析相应95.0%置信区间危险比，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 UCB患者的基本资料98例患者的性别及肿瘤分级、分期等具体情况见表1。

2.2 UCB中HMGB1的表达及与患者临床病例特点的关系本研究通过对98例膀胱尿路上皮癌样本进行IHC检测，发现其中49例为HMGB1低表达(细胞核染色阳性细胞比例≤50.0%)，49例为HMGB1高表达(细胞核染色阳性细胞比例>50.0%)。如图1所示，为不同HMGB1免疫组织化学染色阳性细胞比例的代表图片。如表2所示，在98例患者中，不同N分期UCB患者的HMGB1表达比例之间存在显著性统计学差异(P<0.01)；不同年龄、性别、肿瘤分化程度、T分期、TNM分级及Ki-67增殖系数UCB患者的HMGB1表达比例之间无显著性统计学差异(P>0.05)。

表1 UCB患者的临床病理

A：HMGB1(0%细胞染色)；B：HMGB1(<50%细胞染色)；C：HMGB1(>50%细胞染色)；D：HMGB1(100%细胞染色)。

表2 HMGB1与UCB患者临床病理的关系 [例(%)]

2.3 HMGB1不同表达比例分组患者的生存曲线分析经Kaplan-Meier生存函数分析，HMGB1不同表达比例分组的UCB患者生存率呈现较大差异，其中HMGB1高表达患者的总生存率均明显低于HMGB1低表达患者，差异具有显著统计学意义(P<0.01)，这说明HMGB1高表达的UCB患者预后情况较差(图2)。

2.4 影响UCB患者的预后因素的Cox回归模型单因素和多因素分析Cox比例风险回归模型统计单因素分析显示(表3)，在UCB患者各种临床病例因素中，HMGB1表达比例、肿瘤T分期、N分期、M分期、TNM分级、肿瘤分化程度、Ki-67细胞增殖系数均与预后有关(P<0.01)，而年龄、性别与预后无关(P>0.05)。HMGB1表达比例与UCB患者预后相关性密切(P<0.01)。Cox比例风险回归模型统计多因素分析显示，UCB患者的HMGB1表达比例与预后密切相关，是预测UCB患者预后的独立预后因素。

图2 HMGB1不同表达患者的Kaplan-Meier曲线

表3 UCB患者的Cox回归分析

3 讨 论

HMGB1作为一种高度保守的染色体蛋白，在肿瘤发生发展过程中通过调节免疫、基因组稳定性、细胞增殖、肿瘤转移、凋亡等功能发挥重要作用[9-10]。研究表明，HMGB1在多种恶性肿瘤中表达显著上调，且与患者预后密切相关[11-16]。HMGB1与UCB患者预后可能存在相关性，这为寻找膀胱癌患者的预后分子标志物提供了参考依据[17,18]。由于膀胱癌患者中大多为UCB患者，因此探究HMGB1在UCB患者中的表达情况及预测预后作用具有重要意义。

本研究采用IHC方法利用抗体对组织样本中的HMGB1蛋白表达水平进行检测。通过对98例UCB样本的HMGB1检测，我们发现HMGB1普遍表达于膀胱癌组织中，且与周围正常组织相比，大多癌组织的HMGB1表达比例明显较高。通过进一步对UCB组织的HMGB1表达水平进行IHC评分及分析发现，HMGB1高表达(细胞核染色阳性细胞比例>50.0%)UCB患者与HMGB1低表达(细胞核染色阳性细胞比例≤50.0%)UCB患者相比预后较差。既往有研究表明，HMGB1在膀胱癌中的高表达表现为mRNA和蛋白表达水平均明显高于周围正常组织[19]，且在浸润性尿路上皮癌中表达比例明显较高[17]。YANG GL等[18]通过对164例膀胱癌患者的研究表明，HMGB1过表达与膀胱癌的肿瘤T分期及分级相关，可能提示膀胱癌患者预后较差[18]。目前，在UCB患者中有关HMGB1的表达及与UCB患者预后关系的研究仍较少。

HMGB1导致UCB患者预后较差可能与HMGB1在肿瘤发生发展中的作用有关。有研究表明，HMGB1与肿瘤免疫逃逸关系密切：HMGB1是T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(TIM-3，HAVCR2)的主要配体之一，在肿瘤相关树突细胞中通过与TIM-3结合抑制DNA疫苗和化疗的抗肿瘤作用[20]。除TIM-3外，HMGB1也激活其受体RAGE，从而导致NF-κB途径激活，进而上调白细胞粘附分子，以促进炎症及血管生成[21]。有研究表明，HMGB1高表达与恶性肿瘤进展及血管生成密切相关[22]，可促进内皮细胞增殖和体内新生血管形成[23]。而在敲除HMGB1后，膀胱尿路上皮癌细胞的增殖和侵袭能力受到明显抑制，且对顺铂的敏感性增加[24]。目前也有研究表明，血清HMGB1水平与部分恶性肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、肿瘤大小等因素有关[21]，有望用于预测接受索拉菲尼治疗肝癌患者的预后[25]。以上研究表明组织及血清HMGB1均与多种恶性肿瘤的发生发展关系密切。

综上所述，本研究采用IHC方法对UCB患者组织中的HMGB1表达水平进行研究，发现HMGB1高表达UCB患者预后较差。HMGB1是预测UCB患者预后的独立预后因素，且有望成为评估UCB患者预后的重要分子标志物。