赤霞珠葡萄果实酚成熟度与果皮质地特性的关系

梅 源，金小朵，段冰冰，王 新，苏周晨星，任一曌，刘 旭,2,3*

(1.西北农林科技大学 葡萄酒学院，陕西 杨陵 712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程研究中心，陕西 杨陵 712100；3.西北农林科技大学 合阳葡萄试验示范站，陕西 合阳 715300)

葡萄酒是以葡萄浆果为原料酿造获得的，果实采收时浆果的成熟度是影响所酿酒质量的重要因素之一。目前，生产上主要利用技术成熟度即测定果汁中糖、酸的含量及其比值来判断酿酒葡萄的成熟度，从而决定采收期。但是技术成熟度仅考虑了果肉中糖和酸的含量，忽略了果皮和种子中的花色苷、单宁等酚类物质。这些酚类物质既是葡萄植株体内重要的次生代谢物质，可以缓解葡萄遭受紫外线、病菌和干旱等生物和非生物胁迫的危害，具有抗氧化的功能[1,2]，同时又与葡萄酒的色泽、收敛性、香气等密切相关，是葡萄酒的重要品质因子[3,4]。因此，近年来越来越多的葡萄酒企业在确定果实采收期时，除了测定糖酸的含量外还要综合考虑果皮中酚类物质的成熟度[5-7]。但是，目前酚成熟度的检测具有前处理复杂、检测设备昂贵、检测时间长等问题，如何实现酚成熟度的快速、高效检测是一个亟待解决的问题。

红色酿酒葡萄果实转色后果皮中花色苷含量逐渐增加，单宁含量不变或略有降低[8]。同时，果皮的质地特性也发生着相应的变化[9]。这些变化主要与果实成熟期间果皮细胞壁组分、细胞结构、组织膨压的变化[10]以及由果胶酶主导的果皮细胞壁降解等有关[11-13]。葡萄浸渍发酵期间果皮中花色苷和单宁的释放能力与果皮质地特性密切相关[14,15]。因此，可利用酿酒葡萄果皮的质地特性检测预测果实酚类物质含量。该方法不需要前处理，测定时间短，并且可以实现大量样本的连续检测，从而提高检测的代表性和可靠性[16]。目前国内外的相关研究主要集中于利用酿酒葡萄果皮质地特性预测果皮中花色苷的可提取率等[17]，而基于果皮质地特性检测酿酒葡萄果实酚成熟度的研究较少。因此，本试验以红色酿酒葡萄赤霞珠为材料，研究了采自不同产区、不同时期的果实其酚成熟度与果皮质地特性之间的关系，旨在研究酿酒葡萄果实酚成熟度与果皮质地特性之间的回归模型，从而为酿酒葡萄酚成熟度的快速检测提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试葡萄品种为欧亚种酿酒葡萄赤霞珠(Vitisviniferacv)，2016年和2017年分别在果实成熟期间的E-L35(30%葡萄转色)、E-L36(成熟中期)和E-L38(商业采收期)3个时期进行采样，2 a的采样地均为陕西泾阳、山西夏县、宁夏银川和甘肃武威的酿酒葡萄园(表1)，田间生物学重复3次。

表1 葡萄园基本信息Table 1 Basic information of vineyards

主要试剂：三氯化铁、硫代硫酸钠、牛血清蛋白、偏亚硫酸钾、偏重亚硫酸钠，均购自国药集团化学试剂公司；儿茶素、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

TA-XTplus型物性分析仪，英国Stable Micro System公司；UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司等。

1.3 方法

1.3.1 果实基本理化指标测定 每个重复随机采取100粒浆果，测定粒重。然后从中随机取出20粒，测定纵径(L)和横径(l)，并按如下公式计算果粒体积和表面积[18]。然后人工破碎所有果实，挤出果汁，纱布过滤后测定可溶性固形物含量(°Brix)、还原糖含量、可滴定酸含量和pH值。

体积/mm3=4πabc/3

(1)

表面积/mm2=4π[(ap×bp+ap×cp+bp×cp)/3]1/p

(2)

式中，a=b=l/2；c=L/2；p=1.607 5。

1.3.2 果实酚成熟度指标测定 参考E.Cagnassoetal[19]的试验方法，略有修改。每个重复随机选取50粒浆果，匀浆并称重。将果浆平均分到2个离心管中，在1个离心管中加入20 mL 0.3 mol·L-1(pH1.0)的草酸溶液；另一个离心管中加入20 mL 0.3 mol·L-1(pH3.2)的磷酸溶液，避光浸渍4 h。离心3 min(8 000 r·min-1)后分别移取上清液。采用二氧化硫脱色法测定总花色苷含量(A1.0)和可提取花色苷含量(A3.2)。用pH3.2磷酸溶液浸提后的上清液稀释100倍后在280 nm下测定吸光值A280。总酚指数(total phenols index，TPI)、细胞成熟指数(cellular maturity index，CMI)和种子成熟指数(seed maturity index，SMI)按如下公式进行计算：

TPI=A280×100

人体感应模块，全称为热释电红外的传感器模块，它是一种可以检测人或动物发射的红外线而输出电信号的传感器，只要设置STM32对应的GPIO引脚为输入模式，当有人靠近过时就会检测到高电平，达到报警的功能。引脚图如图5所示。

(3)

CMI/%=(A1.0-A3.2)/A1.0×100%

(4)

SMI/%= [1- (A3.2×0.04)/(A280×100)]×100%

(5)

式中，A1.0和A3.2分别为浆果中总花色苷和可提取花色苷含量/mg·L-1。

1.3.3 果皮中酚类物质含量测定 每个重复随机选取20粒浆果，称重后撕下果皮，蒸馏水冲洗3次。吸水纸吸干后称重。在玻璃试管中加入20 mL丙酮水溶液(丙酮/水=2∶1，V∶V)，加入果皮样品。常温下避光轻微振荡浸提24 h，布氏漏斗抽滤得到提取液。

提取液总酚含量测定采用Adams-Harbertson方法[20]，提取液总单宁含量分别采用蛋白质沉淀法(adams-harbertson，A-H)[20]和甲基纤维素法(methyl cellulose precipitation，MCP)[21]测定。

1.3.4 果实质地特性测定 每个重复随机选取30粒大小相近的浆果，测定果粒赤道线处果皮的硬度。表征果皮硬度的参数为：果皮穿刺力(skin break force，Fsk)、穿刺能量(skin break energy，Wsk)、杨氏模量(Young’s modulus，Esk)。每粒浆果测定果皮硬度后，于赤道线处小心撕下约0.25 cm2的果皮测定果皮厚度，测试条件见表2。

表2 质地特性测试条件Table 2 Operative conditions for textural property analysis

1.4 数据统计与分析

采用SPSS(22.0)软件进行方差分析、多重比较(Duncan分析法，P≤0.05)、Pearson相关性分析、主成分分析(PCA)和多元回归分析(MLR)(表3)。图表采用SPSS 22.0和Origin 2018软件绘制。

表3 用于统计分析的酚成熟度指标和果皮质地特性参数Table 3 Parameters of phenolic maturity and skin textural properties for statistical analysis

2 结果与分析

2.1 赤霞珠葡萄果实基本理化指标的描述性分析

赤霞珠葡萄果实各个基本理化指标数据集的数值都具有较大的变幅(表4)。浆果粒重的变化范围为0.54～1.56 g，平均值为1.10 g。每20粒葡萄浆果的表面积和体积变幅分别为280～655 cm2、442～1 577 cm3，平均值分别为474 cm2、980 cm3。果实可溶性固形物的变化范围从10.10 °Brix到27.50 °Brix，而还原糖、可滴定酸以及pH值的变化范围分别为64～251 g·L-1、4.14～27.31 g·L-1、2.44～4.80。另外，粒重较小的浆果其果粒表面积、体积、可溶性固形物和还原糖含量也较小，而粒重最大的浆果其体积和表面积值也最大，具有最高可溶性固形物的浆果其还原糖含量也最高(数据未列出)。

表4 赤霞珠葡萄样品基本理化指标(n=72)Table 4 Summary statistics of the basic physicochemical parameters for Cabernet Sauvignon grapes(n=72)

2.2 赤霞珠葡萄果实酚类物质含量和酚成熟度的描述性分析

赤霞珠葡萄果实酚类物质含量和酚成熟度的描述(表5)可见，果皮中总酚含量最大值与最小值相差1 461 g·L-1，平均值与最小值相差654 g·L-1，说明样本内总酚含量较大差异。样本中果皮总单宁的含量及其变幅与采用的测定方法有关，MCP法测得的总单宁含量变化范围大于A-H法，2个指标在样本集中的极差分别为1 743 g·L-1和1 135 g·L-1。MCP法测得总单宁的含量在所有样品中的平均值是A-H法测得值的1.2倍，且根据Pearson相关性分析表明二者之间存在极显著相关性(P<0.001，数据未列出)。样本中浆果总花色苷和可提取花色苷含量与果实成熟度密切相关，均在转色初期(E-L35)最低，商业采收期(E-L38)最高。

表5 赤霞珠葡萄果实酚类物质含量及酚成熟度(n=72)Table 5 Summary statistics of the phenolic compounds content and phenolic maturity for Cabernet Sauvignon grapes (n=72)

整个样本中细胞成熟指数(CMI)变幅较大，为44.26%，说明赤霞珠葡萄果实中花色苷的可提取率与成熟状况密切相关。种子成熟指数(SMI)变幅也较大，为93.5%，说明赤霞珠葡萄果实种子中单宁含量占果实单宁总量的比例也与果实成熟进程密切相关。果实总酚指数(TPI)用来反映果实中总酚的水平，可见样本中TPI的变幅相对较小，为29.68，说明赤霞珠葡萄果实成熟期间总酚水平的变化幅度相对较小。

2.3 赤霞珠葡萄果皮质地特性的描述性分析

赤霞珠葡萄果皮质地特性指标包括果皮厚度(Spsk)和表征果皮硬度的3个指标，由表6可见，样本中果皮厚度的变幅较小，最大值与最小值的差值仅为0.24 mm。而样本中果皮硬度指标的极差均较大，最大的为果皮穿刺能量(Wsk)，为0.83 mJ。可见赤霞珠葡萄果实成熟期间果皮厚度的变幅较小，而硬度的变化更加明显。

表6 赤霞珠葡萄样品质地特性(n=72)Table 6 Summary statistics of skin textural properties for Cabernet Sauvignon grapes (n=72)

2.4 相关性分析

主成分分析各变量的载荷图(图1)可见，PC1和PC2 2个主成分的累计方差贡献率为62.2%。酚类物质含量指标如总酚(TP)、总花色苷(TA)、可提取花色苷(EA)、总单宁含量(Tmcp、Tah)等均位于PC1的正向端，酚成熟度指标CMI也位于PC1正向端，与位于PC1负向端的TPI、SMI和Wsk等指标呈负相关。特别是TP、TA、EA以及总单宁含量(Tmcp)等几个指标与PC1呈正相关，而SMI与PC2呈负相关。除了Spsk、Wsk和CMI 3个指标位于PC2负向端外，其余所有指标均分布在PC2的正向端，且果皮质地特性参数在4个象限均有分布。另外，果皮厚度(Spsk)在PC1和PC2上的特征向量值均很低，分别为-0.06和0.031，说明果皮厚度和PC1、PC2的相关性均不强，可能是一个单独的主成分。

为了研究各个指标之间相关关系的显著性，对所有变量进行了Pearson相关分析，由表7可见，果皮厚度(Spsk)与酚类物质含量和酚成熟度指标间均无显著相关性，果皮穿刺力(Fsk)与总酚指数(TPI)呈极显著正相关，而与细胞成熟指数(CMI)呈显著负相关，说明随表征果皮硬度的果皮穿刺力的增大，果实细胞成熟指数(CMI)值变小。果皮穿刺能量(Wsk)与总酚含量(TP)、单宁含量(Tmcp)、总花色苷含量(TA)、可提取花色苷含量(EA)和细胞成熟指数(CMI)均呈现显著或极显著的负相关，而与种子成熟指数(SMI)和总酚指数(TPI)呈显著正相关，该结果与图1中显示的一致。表征果皮硬度的杨氏模量(Esk)与总单宁含量(Tah)呈极显著正相关(r=0.348，P<0.001)。相关性分析表明，赤霞珠葡萄表征果皮硬度的参数与酚类物质含量和果实酚成熟度之间存在良好的相关性。

表7 赤霞珠葡萄果皮质地特性与酚类物质含量及酚成熟度的相关性Table 7 Correlation between skin textural properties and phenolic maturity,phenolic compound content of Cabernet Sauvignon grapes

图1 主成分分析载荷Fig.1 PCA loading plot

2.5 多元回归分析

采用多元线性回归分析(MLR)，选择表征赤霞珠葡萄果皮质地特性的4个指标作为自变量，酚类物质含量和酚成熟度指标作为因变量进行回归拟合，最终只有3个因变量指标(CMI、SMI、TA)具有较好的拟合效果(表8)。对因变量CMI和TA而言，赤霞珠果皮质地特性相关的4个指标均是有效的自变量，拟合模型的决定系数(R2)分别为0.831和0.759。而4个质地特性指标中仅有Fsk、Wsk和Esk为酚成熟度指标SMI有效的自变量，R2值为0.770，P值均<0.001。3个拟合模型的决定系数分别为0.831、0.770和0.759，表示这3个自变量解释了相应因变量83.1%、77.0%和75.9%的变异性。进一步分析的预测结果表明(图2)，预测模型的预测值与实际值具有良好的线性相关性。

图2 MLR建模下赤霞珠葡萄果实酚成熟度和酚类物质含量预测值与实际值的比较Fig.2 Predicted vs observed values of phenolic maturity and phenolic compound content of Cabernet Sauvignon grapes using MLR modeling

表8 多元回归分析结果Table 8 Results of the MLR analysis

3 结论与讨论

酿酒葡萄果实中的酚类物质种类繁多，含量丰富。总酚含量在一定程度上可以全面、综合地反映酿酒葡萄原料质量的优劣及其营养价值的高低，花色苷和单宁含量也与酿酒葡萄的质量密切相关[22]。本试验采用了2种方法测定葡萄果皮中总单宁的含量，其中采用MCP法测定的单宁含量均高于A-H法，这与张振文等[23]在葡萄酒上的研究结果一致。2种测定方法造成的差异可能是由于甲基纤维素和蛋白质与酚类物质结合能力的不同引起的。目前酿酒葡萄果实酚成熟度的测定主要是基于各种酚类物质的提取率，如CMI、SMI[24]和TPI等[19]。葡萄果实中花色苷主要位于浆果表皮下3～4层细胞的液泡里，因此花色苷的提取率与果皮显微结构、质地特性密切相关。而细胞成熟指数(CMI)是浆果中难以提取部分花色苷与总花色苷含量的比值，以衡量葡萄浆果中花色苷的可提取性。前人研究发现，葡萄果皮越厚，花色苷越不容易被浸提出来，即CMI值越大；表征果皮硬度的Esk越大，花色苷越容易被浸提出来，即CMI值越小，而本试验的样本集中2016年和2017年所有葡萄样品均呈现出与之类似的规律，与前人研究结果一致[25,26]。另外，本试验中各产区赤霞珠葡萄的细胞成熟指数(CMI)随着果实的成熟逐渐增加，与E.Cagnassoetal[19]的研究一致。而总酚指数(TPI)和种子成熟指数(SMI)逐渐下降。SMI值在赤霞珠葡萄果实成熟过程中逐渐降低，说明来自于种子的苦味单宁占的比例越低，葡萄的成熟度也越好[27]。

酿酒葡萄果皮质地特性包括果皮厚度和硬度，是表征葡萄果皮物理特性的重要指标。本试验中Spsk随着葡萄果实的成熟逐渐增加，Wsk的变化趋势与果皮厚度相反。而Fsk和Esk的最小值、最大值均为同一时期不同产区的样品，说明同时期不同产区的Fsk和Esk差异较大。另外，不同产区同一生长期、同一产区不同生长期的赤霞珠葡萄样品其果皮厚度均存在一定的差异性，但是差异相对较小。F.Torchioetal[28]研究发现,不同小产地间Barbera葡萄果皮厚度无显著性差异，这可能与该试验中葡萄园地间的气候条件差异较小有关，也可能与Barbera葡萄品种的果皮发育特征有关。硬度表征的是固体物质抵抗永久形变的阻力，反映了组织的表面质地特性[29]。表征葡萄果皮硬度的3个参数：Fsk定义为探针穿透果皮所需要的力，Wsk定义为探针穿透果皮所做的功，为穿刺力和穿刺距离的乘积，说明Wsk除了与果皮穿刺力有关外，还与果皮的厚度密切相关；Esk则表征果皮形变的大小，可定义为果皮的刚性，其数值越大说明果皮越不容易发生永久形变，即果皮越硬[30]。因为Esk与果皮细胞的密度有关，不同地区、不同时期酿酒葡萄果皮Esk的差异应就果皮组织化学特性进行进一步研究。

葡萄果皮细胞壁的结构和物理特性很大程度上决定了果皮释放花色苷的能力[31]。因此，与葡萄果皮细胞壁组成、结构和组织膨压等相关的质地分析可以用来评估果皮中花色苷的提取率，从而间接评估果实中花色苷的含量[10,32]。S.S.Ríoetal[33]也发现葡萄成熟期间果皮中花色苷的提取率和果皮穿刺力、果皮厚度间呈现良好的相关性。本试验的相关性分析中发现，Fsk与CMI呈负相关，这与S.R.Segadeetal[18]在Mencía葡萄上的研究结果一致，说明果皮越硬，花色苷越不容易被提取出来。而果皮中花色苷可提取能力的差异，可能与果皮细胞壁中的多糖(半乳糖和阿拉伯糖)、纤维素含量以及果胶甲基化程度有关[12]。本试验中杨氏模量(Esk)与A-H法测得的总单宁含量呈极显著正相关(r=0.348，P<0.01)，Wsk与MCP法测定单宁含量之间呈负相关(r=-0.511，P<0.01)，说明果皮硬度可以作为预测果皮单宁含量的指标。E.I.Garcíaetal[34]发现，利用浆果硬度可以预测丹魄葡萄果皮黄烷醇的含量。由此可见，果皮质地特性也可以用于预测酿酒葡萄果皮中酚类物质的含量。

本试验的MLR分析表明，表征赤霞珠果皮厚度的参数Spsk和表征果皮硬度的3个参数Fsk、Wsk、Esk与CMI、SMI和TA等酚成熟度指标之间存在显著的线性回归关系，说明4个质地参数可用于预测酿酒葡萄赤霞珠果实的酚成熟度。但是，为了提高预测准确性，应进一步针对不同的葡萄品种、不同产区建立相应的回归关系，并筛选更广泛的果皮质地参数。综上，本试验研究了酿酒葡萄果皮质地特性和酚成熟度的相关性，建立了酚成熟度与质地特性之间的回归模型，其中预测效果最好的指标是细胞成熟指数CMI(R2=0.831)、种子成熟指数SMI(R2=0.770)和总花色苷含量TA(R2=0.75)，试验结果为酿酒葡萄果实酚成熟度快速检测方法的建立提供了一定的理论和技术基础。