新型冠状病毒性肺炎患者样本实验室预处理和安全防护策略的探讨

顾芯瑕， 曹 婷， 姜淮芜， 蒋 欧， 张 标， 刘 杰

（1.四川大学华西临床医学院华西医院感染与疫苗研究室，成都610041；2.绵阳四0四医院，四川绵阳621000；3.内江市第二人民医院，四川内江641100；4.德阳市人民医院，四川德阳618000）

0 引 言

自2019年12月以来，新型冠状病毒性肺炎（COVID-19）迅速从湖北武汉蔓延至全国，各地先后启动了突发公共卫生事件一级应急响应措施［1］。直至2020年4月，确诊和疑似病例开始逐渐下降，各地的应急响应等级相应下调。但疫情仍在继续，特别是境外输入导致的疫情风险不容乐观［2］。作为实验医学和科研人员在这次疫情中承担了繁重的疾病诊断和科技攻关等任务。因新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的传播途径广、传染性强且在当时尚无有效的预防性疫苗和治疗手段，在2020年1月23日国卫办科教函〔2020〕70号发文《新型冠状病毒实验室生物安全指南》（第2版）中将该病原体暂按照病原微生物危害程度分类中第2类病原微生物进行管理［3-4］。未经培养的感染性样本的处理（灭活前的病原学检测、血清学检测、核酸提取、生化分析等），应当在生物安全2级实验室进行，同时采用生物安全3级防护。灭活样本的处理应当在生物安全2级实验室进行。分子克隆等不含致病性病原的处理，可在生物安全1级实验室进行。按照这一要求在实验室开展了COVID-19患者样本的处理，为临床诊断和科学研究提供了有力的支撑。通过这一次实践，操作人员增强了对生物安全的认识，积累了操作经验。并希望分享这些经验，进一步提高实验科学的水平。

1 生物安全防护要求

流行病学资料提示SARS-CoV-2的传播以空气/气溶胶为主，不排除体液和排泄物也是传播媒介［5-6］。这种多媒介的传播特征给患者样本的处理带来较大的生物安全风险，给防护提出了更高的要求。样本处理过程中遵循的安全规范包括使用符合要求的实验空间和设备，选择合理的个人防护装备，遵守个人防护装备的穿脱流程，以及对实验空间和设备的清洁等都是维护生物安全，保障操作人员健康的重要手段，也是避免环境污染的必要措施。

1.1 实验室空间和设备的要求

符合生物安全要求的实验空间是开展COVID-19患者样本处理的基本前提。根据国家卫生健康委员会办公厅《新型冠状病毒实验室生物安全指南》（第2版）要求，COVID-19患者样本在未灭活前应在生物安全2级实验室（Biosafety Level-2，BSL-2）和生物安全3级个人防护的条件下处理。BSL-2分为常压和负压两种类型。因SARS-CoV-2主要经空气传播，建议在具备负压条件的加强型BSL-2中开展COVID-19样本的处理。加强型BSL-2通过负压梯度差实现空气定向从清洁区流向轻度污染区、重度污染区，最后经过滤后排出。空气的定向流动能防止有害因子无序或逆向扩散和防止环境污染［7-8］。样本处理间应配备雾化或紫外消毒设施，以便对空间和物体表面进行消毒。根据中华人民共和国卫生部《消毒技术规范》（2002年版）［9］紫外灯功率要求平均每m3不低于1.5 W。样本处理间的物品摆放应避免遮挡需消毒处理的表面和减少照射的死角。紫外灯的辐照强度至少每月检测1次。检测方法为开启紫外线灯5 min后，用照度计在灯管下方垂直距离1 m的中心处测量其辐照度值（μW/cm2），有效辐照度值应≥70μW/cm2。根据《消毒技术规范》（2002年版）灭活病毒的照射剂量为0.1 W·s/cm2，需照射的时间是：0.1 W·s/cm2÷70×10－6W/cm2＝1 429 s÷60 s≌24 min，所以结束实验后样本处理间和生物安全柜至少进行1 h的有效紫外照射。选择符合要求的实验空间和使用有效的清洁措施是从物理防护和化学消杀两方面确保生物安全的基本要求。

开展COVID-19患者样本处理的设备也应满足相应的生物安全要求。样本组织的操作均应在Ⅱ级A2型生物安全柜中进行。生物安全柜分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ防护等级［10］。Ⅰ级生物安全柜不保护样本可保护工作人员和外界环境，在排气口设置了高效过滤器。Ⅱ级生物安全柜依照进气、排气和循环方式等可分为4个型号，分别为A1，A2，B1和B2型。其中以A2型（30%外排，70%内循环）和B2型（100%外排）为主。Ⅱ级生物安全柜的型号选择不以生物因素决定，而是视操作是否有毒化品或放射性物质。涉及毒化品或放射性物质需选择B2型，低致病性生物样本选择A2型。Ⅲ级生物安全柜是为生物安全3、4级实验室（BSL-3或BSL-4）设计。柜体完全气密，工作人员通过连接在柜体的手套进行操作（俗称手套箱），适用于高致病性微生物。Ⅱ级A2型生物安全柜工作区域（污染部分）始终处于负压状态，前窗的垂直下降气流维持与外环境的隔离。操作过程中形成的气溶胶或者污染气体经负压通道传输到风道，再通过超高效空气粒子过滤（HEPA过滤，对＞0.3μm的微粒过滤效率≥99.99%）排出，避免操作人员和环境暴露于污染气溶胶。建议在离心操作时选用吊桶配备密封盖的离心机，防止离心机高速运转过程中腔体内形成污染性气溶胶，也避免试管意外破损后样本泄露造成离心机甚至整个实验空间的污染。离心结束后至少静置5 min再开盖［8］，开盖后可用75%乙醇喷洒离心机腔体以减少气溶胶污染的风险。样本灭活可以选用热空气法或水浴法。恒温孵育箱或水浴锅应置于样本处理间内，且提前加热到56℃。根据国家卫生健康委员会办公厅发布的《新型冠状病毒性肺炎诊疗方案》（试行第7版）［5］，SARS-CoV-2对热敏感，在56℃30 min的条件下即可灭活。热空气灭活法应注意保持样本间距。水浴灭活法水的液面应不低于样本液面，使样本均匀受热以达到有效灭活。不论空气或水浴灭活均应设置参考温度计，以确保样品中心部分达到要求的灭活温度和时间。因此，不仅仪器设备的技术参数要满足生物安全要求，同时正确使用和质量控制也是保障生物安全和样本质量的必要条件。

表面化学消毒剂也是保障生物安全的必备用品。其选择决定于有效性和消杀表面的耐受/接受性。我们建议在样本处理前准备足量的有效消毒液。按照国家卫生健康委办公厅《新型冠状病毒实验室生物安全指南》（第2版）［3］的要求，如发生操作失误或意外造成的污染，用到的消毒剂包括有效氯含量为0.55%的消毒液（5 000 mg/L）、2 g/m3的过氧乙酸、8 g/m3的高锰酸钾－10 mL/m3甲醇（40%）混合液。除此之外，对转运箱、包装袋和样本采集管表面处理需使用75%的乙醇。穿脱个人防护用品过程中需速干手消毒液或75%的乙醇。其中，过氧乙酸和含氯消毒剂包括漂白粉、次氯酸钠、次氯酸钙（漂粉精）、二氯异氰尿酸钠（优氯净）、三氯异氰尿酸等属于高效消毒剂；醇类及其复配消毒剂等属于中效消毒剂；市面上速干手消毒液，包括醋酸氯己定、葡萄糖酸氯己定等双胍类消毒剂等，属于低效消毒剂［9］。氯己定已不能用于SARS

Cov-2的消毒处理［5］。化学消毒剂的选择应严格参照要求和认真阅读说明。

1.2 个人防护要求及注意事项

针对SARS-CoV-2多种传播途径的特点，操作者的个人3级防护是处理非灭活样本的基本要求。除常规的一次性帽子、手套、鞋套、连体防护服外，重点避免呼吸道和眼部黏膜的暴露，配备医用防护口罩防止气溶胶的吸入，佩戴护目镜防止气溶胶接触或样本飞溅入眼部。但应注意区分安全镜和安全护目镜。安全镜与面部不贴合，难以达到保护效果。而安全护目镜与面部贴合，能有效阻止感染性气溶胶和液体飞溅入眼部。建议穿戴防护用品在实验室清洁区完成。其顺序为：更换手术洗手衣、实验室用鞋→医用防护口罩→双层防护帽→双层鞋套→连体防护服→靴套→护目镜→一次性防水隔离服（可选）→双层乳胶手套。在连体防护服外增加一次性防水隔离服，能避免液体浸染连体防护服，也便于沾染后的消毒和更换，避免操作者返回缓冲区更换。褪脱防护用品应遵循先外后里的顺序。实验结束后用75%酒精喷洒胸前、手腕（特别是手套和防护服袖口结合部位、防护服领口部位）。最外层的手套和一次性防水隔离服应在污染区脱掉，更换新的手套再进入缓冲区。脱摘流程依次为：75%酒精喷洒胸前、手腕、手套→摘护目镜→脱靴套→脱连体防护服→摘第一层手套→摘口罩和防护帽→脱鞋套→摘第二层手套→洗手或手消毒。一次性隔离服和连体防护衣脱离时均应把向外的污染面卷向里面，将其折叠或卷成包裹状，且褪脱和折卷动作要轻缓，避免表面附着的污染物因剧烈抖动造成空气污染，避免防护服污染面接触内层衣物。防护装备褪脱前对胸前、手腕、手套进行75%酒精喷洒可以降低褪脱过程中发生接触污染的风险。应将穿脱程序用文字和图示张贴在更衣区，提示实验人员按正确的步骤有序进行，且由两人相互协助，并相互检查确保正确穿戴和褪脱。

强调戴口罩前洗手或手消毒，在佩戴过程中避免手接触到口罩内侧，降低污染的风险。根据自己的脸型调整好口罩的位置后，应用两手的食指沿着口罩的上缘按压鼻夹，使其与面部紧贴。戴上口罩后，用力呼气，空气不能从口罩边缘漏出。男性必须刮净胡须，确保口罩能够与脸部的密合良好。在医用防护口罩临时得不到充足供应的疫情早期，采用在N95/KN95口罩外层增加医用外科口罩，以达到医用防护口罩的防护效果。通用N95和KN95口罩的区别在于N95是执行美国联邦法规CFR 42-84-1995《NIOSH Guide to the Selection and Use of Particulate Respirators》（NIOSH颗粒物防护口罩的选择和使用指南）的标准。N（Not resistant to oil）代表不耐油，能阻隔的污染物类型是固体和水基微粒，测试时使用氯化钠；KN95执行的是中国GB 2626-2006《呼吸防护用品自吸过滤式防颗粒物呼吸器》标准，过滤非油性颗粒物KN类［11-12］。通用N95和KN95口罩是防尘设计，不防液体喷溅。而医用防护口罩执行中国GB 19083-2010/欧洲EN 14683-2019《医用口罩要求和试验方法》等相应的标准［13-14］，不仅过滤空气中的颗粒物，还能阻隔飞沫，对血液、体液、分泌物等有防喷溅的功能。医用外科口罩（中国行业标准YY 0469-2011《医用外科口罩》）的细菌过滤效率≥95%，对非油性颗粒的过滤效率仅要求≥30%，另外对血液的穿透能力、承受的压力差等也有相应的要求［15］。在特殊时期结合实际供应情况，按照防护要求，合理选择和正确使用口罩，采用N95或KN95口罩和医用外科口罩的搭配，加强了N95或KN95口罩防喷溅效果，确保操作者呼吸道的安全。

手是高风险部位。因此要求双层乳胶手套的防护，并在使用前常规检查气密性。手套腕部应遮盖防护服袖口，减少皮肤的暴露。操作过程中，若外层手套被污染应立即喷洒消毒后脱去，弃于生物安全柜内的垃圾容器中，并更换上新的外层手套。禁止在实验过程中手套接触面部和面部防护用品，避免触摸不必要的物体表面，如灯开关、门把手等。在个人摘脱防护用品前，应先更换新手套。保护好手部的安全和禁止与面部等清洁部位的接触是减少病原体污染的关键。

2 样本收集所需耗材及使用

（1）COVID-19患者血液样本的收集。根据需求选择相应的采血管，收集血清常用红头或黄头管，收集血浆和血细胞常用紫头或绿头管。红头管不含添加剂，采集的血清用于常规生化分析；黄头管含促凝剂和惰性分离胶更便于血清的分离，离心后血块和血清被惰性分离胶隔离，便于直接上机检测和标本的保存，而对电解质、酶类等敏感指标的稳定性影响小。建议对血清采集管离心5～10 min处理后再转运，以避免溶血和保证样本质量。紫头管内含有乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA）以及其盐，能有效地螯合血液中的钙离子，阻止和终止内源性或外源性凝血过程。EDTA对血球的凝集及血细胞的形态影响较小，而绿头管内添加有肝素，过量肝素会引起白细胞聚集，不能用于白细胞计数和分类。若有其他特殊需求，可选择相应类型的采血管。

（2）咽拭子采样管含Hank’s保存液。若开展病毒分离，可选择性添加抗生素、抗真菌剂、牛血清白蛋白（BSA）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）、氨基酸、甘油等。BSA、HEPES等可在较宽的温度范围内稳定细胞活性，减少核酸的降解和病毒活性丧失，以保障病毒分离的成功率。咽拭子样本收集后装入双层密封袋中，置于感染性样本低温转运箱中转送。样本应于24 h内完成预处理和转至超低温保存，以保证检测结果的可靠性。

（3）尿液应转移至密闭容器中转运。一次性尿杯密闭性差，在转运交接过程中容易发生泄漏和样本间交叉污染，不仅影响检测的准确度，且增加样本转运和处理过程中的安全风险。建议尿液在院内收集后转移到带有螺旋盖的密闭无菌容器（如50 mL的离心管）内转运。且每例病人的尿液样本用密封袋单独包装。

（4）大便收集于无菌采集器中应尽快处理或送检。由于大便中含有大量的消化酶，应叮嘱患者收集新鲜的大便，采用低温保存和1 h内送样，保证大便中病毒核酸的完整性。

3 样本处理风险及应对建议

为缩短在3级防护条件下的操作时间，减少因心里和工作压力带来的标记失误，在收到采样信息后，实验室工作人员可提前根据样本信息准备标签，预先准备和标记样本处理、分装和保存所需的容器。我们选择防酒精的记号笔标记冻存管，避免常规标签纸在液氮中脱落和普通记号笔标记遇酒精喷洒洗脱。安排至少2人在样本处理间和3级防护环境下相互配合处理样本，另外1人在样本处理区外协助，传递必要的试剂、耗材和提供其他辅助，以免穿着3级防护服的操作人员反复进出操作间，造成安全隐患和防护物资的浪费，也节省了多次穿脱防护服的时间。减少在3级防护条件下的工作时间，减少人员的穿梭能提高样本处理过程的安全性。

样本在灭活过程中确保均匀受热以达到有效灭活，应注意水浴锅中水的液面高度不能低于样本液面的高度，尤其是体积量较大的尿液样本。血液样本的预处理过程中，不建议灭活后分离血清或血浆。红细胞受热和震荡易诱发溶血，有核细胞因细胞膜受损也会释放胞浆内容物，影响检测的准确性。咽拭子样本灭活后在生物安全柜内开盖，将管内的咽拭棉签在管壁上轻柔挤压后弃去，避免用力过度将棉签折断，发生感染性液体飞溅。

4 废弃物的处理和操作间消毒

首先要确保废弃物无遗漏和泄漏。为保证垃圾袋的完整性，防止尖锐物品如吸头或移液管等戳破垃圾袋，至少使用2层生物医疗专用垃圾袋，且垃圾量不超过垃圾袋容量的2/3。收集过程中无挤压。直接接触患者样本的固体废弃物应置于生物安全柜中的垃圾桶中，实验结束后双层垃圾袋分层密封，表面经75%乙醇处理后转移出生物安全柜。感染性液体废弃物，如尿液样本、细胞洗涤液、培养基等倒入安全柜内的最终有效氯含量为0.55%的废液缸中，实验结束后在生物安全柜内加盖，表面经75%乙醇消毒后，并置于双层医疗废物垃圾袋密封后移出生物安全柜。所有垃圾需经121℃，30 min高压灭菌。并建议灭菌处理设置为非排气模式，避免灭菌设备在排气过程中造成意外的环境污染。灭菌处理后的垃圾置于医疗废物暂存点保管和登记，交具备资质的生物医疗垃圾处理公司处理［16］。

实验结束后，需对生物安全柜等不锈钢台面采用喷洒75%乙醇后用纸巾擦拭的方式清洁；对于操作间地面和实验桌台面采用喷洒有效氯为0.55%的消毒液清洁。然后对生物安全柜和整个操作间进行紫外消毒≥1 h。

5 应急处理

整个样本处理操作过程中应认真、仔细、沉稳，避免操作失误带来的安全隐患。《新型冠状病毒实验室生物安全指南》（第2版）中建议的应急消毒法有0.55%有效氯消毒液（排除氯己定）、2 g/m3过氧乙酸熏蒸过夜或20 g/L的过氧乙酸用气溶胶喷雾器进行8 mL/m3的剂量进行喷洒1～2 h，必要时使用高锰酸钾（8 mL/m3）—甲醛（10 mL/m3）混合液熏蒸4 h以上。但对于过氧乙酸和高锰酸钾都属易制爆管控物，采购的审批手续复杂且耗时，对存放和管理要求高，建议在非特殊情况下使用高效消毒剂次氯酸钠，如84消毒。这类消毒剂应用范围广、购置方便和容易保存。但应在配制后24 h内使用才能保证消毒效果。若在生物安全柜内发生泄漏造成局部污染，使用现配的有效氯含量0.55%的消毒液喷洒处理，并及时擦拭干净，减少对不锈钢的腐蚀。

6 结 语

本次COVID-19的爆发是继2003年的SARS疫情后再一次对公共卫生系统生物安全防控体系的考验，对临床医疗和科研应急能力的挑战。在这一次考验和挑战中检验了生物安全实验平台的建设成效，锻炼了平台的管理队伍，培养了具备生物安全知识的后备力量。还需在工作中进一步总结经验，对存在的不足进行改进和完善，逐步健全实验平台的生物安全防控体系，为基础研究和临床实践提供有力的技术支撑。