蛋白多肽类药物长效化技术研究策略

庞丽然, 贺丞, 魏敬双, 高健

华北制药集团新药研究开发有限责任公司, 抗体药物研制国家重点实验室, 石家庄 050015

治疗性多肽和蛋白质具有结合力高、特异性强、溶解度高、毒性低的特点，大量的蛋白质和多肽疗法进入了医药市场[1]。但是除抗体类药物外，大多数蛋白类药物半衰期较短，必须通过频繁给药或提高剂量才能达到预期的治疗效果，这样不仅给病人带来巨大的痛苦和潜在的风险，也给病人带来了巨大的经济负担。因此，为了延长治疗肽和蛋白质的半衰期，提高其药代动力学/药效学性质，人们在化学改造、基因工程和药物动力学等方面进行了大量的研究，已开发了多种有效的长效策略。

1 决定半衰期的重要因素

多肽和蛋白质通常比小分子更不容易穿过上皮细胞，更易被宿主代谢，所以大多数生物药物都是通过皮下或静脉注射给药的。蛋白质疗法在临床应用中面临的最大挑战之一是其在血清中的快速降解，以及由于酶降解、肾清除、肝代谢和免疫原性而导致的快速消除[2]。除了单克隆抗体具有长达一周的血清半衰期外，大多数蛋白类药物很快就会从体内消失，半衰期短。

蛋白质的去除率依赖于多种因素，比如尺寸、分子量、表面电荷等[3]。蛋白质分子的大小和疏水性使其易于肾脏滤过和肝脏代谢。肾滤过阈值约为50～60 kD，生物制药分子量在60 kD以下的通过肾脏过滤。另一方面，生物体内广泛存在各种蛋白水解酶，负责蛋白质破坏的蛋白酶体具有特异性识别几乎所有外来蛋白质的能力，同时能够避免对细胞成分的任何不必要的破坏；生物药物在细胞膜上的渗透性很差，而细胞摄取途径通常导致溶酶体中的药物降解。因此，半衰期延长策略的成功与否取决于该技术能否操纵一个或多个这些因素。

2 聚合物类对治疗性蛋白/多肽的修饰

2.1 聚乙二醇(pegylation, PEG)修饰

聚乙二醇化(PEG)是20世纪70年代一种很受欢迎的蛋白质修饰技术。聚乙二醇本身是一种不带电的亲水聚合物，不可生物降解，大部分无毒性[4]。PEG链是由环氧乙烷(CH2-CH2-O)的重复单位构成的分子。肽链共价连接在一个或多个高分子量PEG链上，赖氨酸和多肽链的 N-末端的氨基酸残基是最常用的 PEG 化位点。延长半衰期的作用是通过隐藏肽的抗原决定因素，使抗体不能认识到它是一个异物，并增加蛋白质的大小，使它不会被肾脏轻易清除。高度灵活的聚乙二醇分子很容易附着在治疗分子上。聚乙二醇化也有助于吸收,增强蛋白质的水溶性，并掩盖分子避免蛋白水解或降解[5]。PEG一般认为是安全的，然而并不是百分之百安全，因为它是不可被生物降解的，具有免疫原性。从目前已上市的几种PEG化药物的情况来看，长效化效果明显[6]。

非格司亭(filgrastim)是一种重组蛋氨酸人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，在化疗期间能够刺激中性粒细胞的供应预防胎儿中性粒细胞减少症(FN)，需每日注射。聚乙二醇化的非格司亭为乙二醇化非格司亭，它只需要每个周期注射一次[7]；Enzon开发的Oncaspar，是PEG化的L-天东酰胺酶，半衰期比原L-天东酰胺酶延长了16倍[8]。Amgen的短效化GCSF在一个化疗周期需要多次注射，而其长效化的PEG-GCSF(neulasta)一个化疗周期中只需给药1次即可维持药效[9]。国内上市的PEG化生物药物有石药集团的聚乙二醇化重组人粒刺激因子(PEG-rhG-CSF)、长春金赛的聚乙二醇化重组生长激素PEG-rhGH等。

2.2 改性的PEG修饰

在过去的几十年里，研究人员一直在努力研发PEG偶联疗法，将聚乙二醇修饰和共轭到其他分子上。

2.2.1糖基化-PEG修饰传统上，PEG通过共价键连接到氨基酸反应基团上与蛋白质结合。新的糖基化-PEG修饰方法将PEG连接到O-聚糖上。因此，它由糖基转移酶位点定向聚乙二醇化。该方法可以使形成的异构体最小化，同时能够提高PEG延长半衰期的性能[10]。

2.2.2生物素化的PEG修饰近年来，通过将聚乙二醇与链霉亲和素偶联得到了一种改性聚乙二醇[11]。研究表明，采用生物素化-聚乙二醇技术，可以改善循环停留时间。它具有巨大的潜力，可用于蛋白质和肽治疗的药物动力学增强剂。

3 重组多肽类对治疗性蛋白/多肽的修饰

近年来，蛋白质半衰期延长的新技术不断涌现，包括非结构多肽链。就像聚乙二醇，多肽聚合物附着到蛋白质上，增加它们的水动力半径，使它们不易于肾滤过。但与聚乙二醇不同，多肽聚合物可生物降解,无毒、无免疫原性、亲水，属中性聚合物。另外，多肽聚合物的合成技术简单，效益也很高[12]。

3.1 非结构多肽XTEN

XTEN是Amunix公司开发的蛋白质聚合物，用途广泛，可替代非生物降解的聚合物，用于延长半衰期。XTEN是一种非结构多亲水性、可生物降解的蛋白质聚合物，由数量有限的单体组成。XTEN具有多肽的性质，使其有望用于延长半衰期[13]。与化学聚合物不同，XTENs没有特定的结构。和聚乙二醇一样，XTEN也能延长蛋白质的半衰期，增加分子的大小和水动力半径，这说明，XTEN是很好的PEG替代品。XTEN由大肠杆菌表达，包含A、E、G、P、S和T的氨基酸序列库。已有研究将XTEN多肽与Exenatide、胰高血糖素(Gcg)、胰高血糖素样肽2(GLP2)类似物[14-15]，膜联蛋白等进行融合，测试评估其效果，表明XTEN能够增强药物的半衰期和降低免疫原性[16]。

3.2 脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸(PAS)

PAS是慕尼黑工业大学开发的另一种多肽聚合物，工作原理与PEG类似，具有生物可降解的多肽分子的所有特性[17]。PAS是一种100～200重复序列的非结构肽聚合物，是由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸这3种氨基酸随机排列而成的重复序列。PAS聚合物对血清蛋白酶有抗性，但仍然存在可被肾脏蛋白酶降解的风险。PAS多肽是无毒的，缺乏T细胞表位，在动物实验无免疫原性征象[18]。PAS多肽已被广泛应用于治疗多肽和蛋白质，包括激素、细胞因子、抗体片段与酶[19]。研究表明生物制药的半衰期也可以通过改变PAS聚合物的长度很容易地调整，来实现特定的应用[19-20]。最初有3种蛋白作为模型药物进行了测试：重组Fab片段、干扰素α2b(IFN α2b)[21]和人类生长因子(生长激素hGH)。不同的PAS序列与Fab片段结合，使半衰期增加2～25倍。rFab本身单独半衰期只有1.34 h，PAS修饰后半衰期为2.71～37.00 h。研究显示PAS修饰的 IFN半衰期增加了5～30倍，hGH半衰期增加94倍。除此还有多种生物活性蛋白与200～600个残基的PAS融合，比如IFNβ激动剂、小鼠瘦素[22]和人铁蛋白[23]。

3.3 类弹性蛋白多肽ELP

另一种多肽融合技术是类弹性蛋白多肽(elpylation)。就像XTEN和PAS，ELP也是含有V-P-G-x-G重复序列的随机序列，主要存在于弹性蛋白中，x指的是除脯氨酸以外的任何氨基酸[24]。由于它与弹性蛋白具有较高的相似性，这使得它更容易被人类的弹性酶识别降解，赋予了它可生物降解的特性。ELP像PEG及其他多肽聚合物一样，通过增加水动力半径以延长半衰期，已被用于延长肽和蛋白质的半衰期[25-26]，包括IL-1受体拮抗剂、IL-4、IL-10、GLP-1和HIV中和抗体等。有趣的是，GLP-1-ELP融合蛋白在室温和体温之间表现出溶解-不溶解相变。可形成一个具有缓释特性的注射存库，可在单次注射后，使小鼠的血糖水平降低维持5 d[27]。据报道描述，IL-1受体拮抗剂-ELP 融合蛋白也会有类似的结果，注射后形成一个药物存库[28]。

3.4 富含甘氨酸的聚多肽(HAP)

HAP修饰是一种富含甘氨酸(Gly4Ser)n多肽的重复序列的活性分子，由100～200的重复残基组成。HAP修饰在动物模型中显示对Fab的半衰期呈上升趋势。200个HAP残基偶联到Fab残基显示在体内有较长时间的半衰期(6 h)。但研究遇到了一个重大难题是(Gly4Ser)n的溶解度与半衰期之间的矛盾:HAP溶解度依赖于链长，链长增加会大大降低溶解度。然而较短的链不能很有效地提高半衰期，因此这种技术没有得到进一步发展。

3.5 明胶样蛋白(GLK)

明胶样蛋白(GLK)是一类具有生物活性的重组多肽，可用于延长半衰期，它是由(Gly-XY)n的重复序列组成，其中X和Y指除Cys除外任何天然的氨基酸，n是在60～1 500个氨基酸残基之间(最好是200～1 000)，分子量为6～150 kD(最好是20～80 kD)。通过基因融合制备的不同GLK修饰的G-CSF，使其在大鼠中的半衰期从1.76 h延长到10 h。

4 天然蛋白或蛋白结构域对治疗性蛋白/多肽的修饰

有一些天然的蛋白质分子具有超长的半衰期，因此血清白蛋白和转铁蛋白等蛋白首先被认为是延长其他治疗性蛋白半衰期的基团。转铁蛋白的半衰期较长是由于与网格蛋白依赖的转铁蛋白受体结合，而白蛋白的长半衰期是新生儿Fc受体(FcRn)介导循环的结果。pH依赖的FcRn受体介导的循环作用机制也适用于人免疫球蛋白IgG抗体[29-30]。

4.1 与白蛋白结合

白蛋白具有一些独特的特性，如血浆半衰期约19 d，负电荷表面具有多价结合位点等，这使该分子成为理想的肽类药物的运载工具和半衰期延长剂的候选物。Albiglutide(Tanzeum)是第一个直接与HSA融合的治疗蛋白，它在2014年被FDA批准用于治疗T2DM[31]。Albutrepenonacog alfa(Idelvion)是一种重组蛋白人凝血因子IX(FIX)融合蛋白，于2016年获得FDA批准用于血友病B患者的出血治疗与预防。Albutrepenonacog alfa蛋白的半衰期为90～104 h, 比原蛋白FIX的半衰期(18～34 h时)长5倍。

4.1.1与白蛋白的非共价结合在辅助分子的帮助下，比如通过非共价键连接脂肪链，实现白蛋白与治疗性肽间接结合。白蛋白是研究充分的转运蛋白，能够有效并可逆地结合一系列内源性配体包括脂肪酸、胆红素和少数外源性配体，如青霉素、华法林、安定等。使用脂肪酸作为配体也被称为“脂化”。白蛋白与这些分子结合提高了它们的生物利用度。利用该技术开发的两个著名的多肽药物是地特胰岛素(levemir©)和利拉鲁肽(victoza©)[32-33]。

4.1.2与白蛋白的共价偶联治疗性蛋白药物与白蛋白分子的共价结合是另一种延长蛋白半衰期的途径。它可以通过蛋白质和白蛋白的化学结合来实现。直接将蛋白药物与转基因白蛋白或白蛋白衍生物而不是内源性白蛋白结合，进一步为延长半衰期提供了灵活条件。化学偶联的优点是治疗分子与白蛋白的连接位点不再局限于N 端或C 端。PC-DACTM是一种体外HSA 预耦合技术，将蛋白质/多肽连接子复合物在体外与HSA 蛋白进行偶联，直接形成治疗分子白蛋白复合物。研究者通过该技术对艾塞那肽进行修饰，然后再与重组人血白蛋白结合。艾塞那肽是一种天然存在的肽激素，对治疗糖尿病具有很好的作用。但半衰期只有33 min，糖尿病患者需一天注射一次。通过PC-DACTM可以延长艾塞那肽的血浆半衰期，从而使药物作用时间延长。该药物在体内的半衰期可达到7 d，因此临床上可以做到患者每周只需注射一次，极好地增加了患者的使用便捷性并能更稳定的控制血糖。白蛋白衍生物是一类对延长血清半衰期具有广泛应用前景的重组蛋白。

4.1.3与白蛋白的基因融合与共价结合一样，基因融合技术也能制备与白蛋白结合的融合蛋白。这提供了一个更简单的程序，由于制造过程发生在生物体或细胞系内，并完全折叠成功，可直接收集蛋白[34]。治疗肽可在白蛋白的一端(N或C端)或两端(双特异性白蛋白融合)与白蛋白结合。HSA融合的蛋白药物是非糖基化还是糖基化蛋白决定了采用酵母或CHO细胞表达，成本低且纯化方便，使得其具有作为药物长效化载体的经济效益性。HSA融合蛋白的主要优点是其免疫原性低、作为惰性蛋白能增加蛋白稳定性[35]。

4.2 Fc融合

IgG偶联蛋白延长半衰期主要是基于Fc域融合。结构上，IgG的恒定区域 Fc区为二价，为药物结合提供了灵活性[36]。从概念上讲，二价结合是亲和效应的一个额外优点。蛋白质分子可以添加到Fc中区域融合位点(N端或C端)或插入环路形成[37]。首个Fc融合蛋白依那西普(Enbrel)1998年获得FDA批准用于治疗类风湿性关节炎。多肽的药代动力学特征可以通过基因融合到Fc结构域的两个分支上而得到改善，从而产生双价结构融合蛋白。Dulaglutide(Trulicity)，GLP-1受体激动剂每周注射一次，在2014年被批准用于治疗2型糖尿病(T2DM)。Dulaglutide由两个具有多个突变的相同GLP-1分子组成(A8G/G22E/R36G)，通过一个小肽链融合到IgG4-Fc区(F234A/L235A)。Dulaglutide的半衰期延长至5 d左右,与埃克西纳替德(exenatide)、利拉格鲁肽(liraglutide)和利克西纳替德(lixisenatide)相比半衰期要长得多，这些药物必须每日服用1～2次[38]。

Fc作为半衰期延长手段的另一个应用是单分子Fc的利用。Efraloctocog-α(eloctate)包括一个凝血因子ⅧB域与Fc二聚体融合，并被批准用于治疗血友病A，efraloctocog-α半衰期为19 h，而重组因子Ⅷ延长了1.5倍。两种用于治疗Eftrenonacog-α(Alprolix)的单价Fc融合蛋白被FDA批准用于治疗血友病B[39]，由单一FIX，融合到IgG1的Fc二聚体。Eftrenonacog-α的半衰期为53～82 h，比重组FIX(19 h)长3～5倍[40-41]。除了延长半衰期外，Fc融合有时还能改善蛋白质的生理机能，如增加溶解性和稳定性。在Fc介导的半衰期延长的制剂药物中，ADCC具有抗体依赖性细胞毒性，CDC具有互补依赖性细胞毒性，这些问题通过CH3-CH3杂化得到了解决。

4.3 转铁蛋白融合

血清转铁蛋白能够与铁分子可逆结合并将其转运到组织。转铁蛋白在血清中的半衰期是7～10 d(非糖基化Tf为14～17 d)，它作为融合分子是延长蛋白质半衰期的良好候选物[42]。有一项研究有关丙胰岛素与转铁蛋白融合(ProINS-Tf)。ProINS-Tf融合蛋白在老鼠体内，显示具有较长时间的半衰期，能够缓慢持续地降糖。ProINS-Tf血清中的半衰期为7.29 h，而ProINS半衰期只有0.5 h[43]。

5 碳水化合物对治疗性蛋白/多肽的修饰

在生物系统中，糖基化起着维护蛋白质的稳定性及防止酶降解的作用。糖基化是蛋白质与碳水化合物的共价修饰。蛋白质的固有性质是由连接在它链上的糖分子改变，最终改变其四级结构的稳定性和对蛋白酶的抗性。这种自然保护系统可用于设计新的延长半衰期的生物疗法。此外，寡糖基化合物还具有增大尺寸、通过在蛋白质中添加负电荷来降低肾清除、调节受体介导的内吞作用、防止蛋白水解降解等作用，使糖基化成为延长治疗半衰期的常用方法[44]。糖基化位点的引入增加了肽或蛋白质的负电荷，导致肾清除速度减慢[45]。商用EPO类似物，Darbapoietin α含有两个额外的N糖，其半衰期为26.3 h，是原生半衰期的3倍。

5.1 聚唾液酸化(polysialylation)

天然产生的唾液酸聚合物(PSA)是碳水化合物链，可生物降解，在自然界高度亲水，在体内并没有确定的受体。因此，翻译后修饰的治疗肽和蛋白质末端唾液酸能改善药物的药代动力学，降低免疫原性，从而改善他们的整体效率[46]。Jain等[47]研究发现，多唾液酸化胰岛素对于糖尿病的治疗具有明显的治疗价值。他们发现与正常胰岛素相比，胰岛素与22 kD PSA聚合物结合，体内治疗显示它能较长时间地降低血糖水平，延长药物作用时间。类似的结果也发生在其他几项蛋白疗法研究中，如抑肽酶和IgG免疫球蛋白。聚唾液酸化的丁酰胆碱酯酶(bChE)，使它在小鼠体内半衰期从3 h延长到14 h。多种多唾液酸生物治疗药物正在临床开发中，如PSA-EPO(ErepoXen)、PSA-DNaseⅠ(PullmoXen)、PSA-RFⅧ等。

5.2 HEPylation

肝素前体(HEP)是一种天然多糖，水溶性好。HEP作为肝素的前体，它被机体认为是体内物质，因此不会产生任何免疫原性问题[48]。Wei等[49]用肝素前体代替PEG与重组人粒集落刺激因子(G-CSF)结合，在小鼠体内长时间重复剂量给药，并不会引起毒性反应及免疫原性反应，肝素前体是一种安全的PEG替代品。因此，它被认为可用于延长半衰期，并且可做为生物降解的一个很好的选择。肝素前体及其衍生物因具有作为多种药物制剂的潜力备受关注。肝素前体在血液中的半衰期为15 h～8 d，这取决于分子量和给药途径。

6 展望

长效蛋白药物具有极大临床优势，延长半衰期已成为许多生物疗法发展的一个重要策略，诸多长效蛋白药物已成功开发上市。长效创新药使给药频次大大降低、依从度更高、治疗效果更优。随着生物技术的发展，也给长效化带来了新的思路，开发其他剂型及给药途径也日益受到关注。研究人员开发了各类药物传递系统(DDS)，包括缓释注射剂、植入剂、微球注射剂[50]、脂质体注射剂[51]及纳米粒注射剂[52]等。目的是通过载体控制药物的释放、提高药物的稳定性，同时提高难溶药物的溶解性及靶向性。研究者也尝试通过口服或经皮给药替代注射给药途径。在长效策略研发过程中也有一些挑战需要解决，临床安全和免疫原性问题一直存在。对任何延长半衰期的策略进行充分的PK和PD研究，消除副作用，同时也要综合考虑药物特性、生物因素、临床需求、生产成本等各方面因素。从长远来看，蛋白及多肽类药物的长效化具有重要的临床意义和广阔的市场前景。虽然许多新颖的延长半衰期的策略仍处于临床前阶段，但是可以预测越来越多的此类技术将会克服发展障碍，并在未来的临床试验中得到评估，研发出活性更好且更加长效的蛋白多肽类药物。