石榴补血糖浆对Wistar 大鼠贫血症影响的探究

莫国艳韩祥志穆丹丹董雨薇韩林涛∗黄 芳尹 强∗

(1.湖北中医药大学,武汉 430065; 2.新疆维吾尔药业有限责任公司,乌鲁木齐 830026)

血虚症指血液亏虚,形体失养,以面色淡白,唇舌色淡,心悸多梦,手足发麻,等为常见证候。 与西医中的红细胞生成减少性贫血,失血性贫血,红细胞破坏过多性贫血等疾病相对应。 铁是形成血红素的必需元素,血红素是合成血红蛋白的原料,含铁元素蔗糖溶液或复方硫酸亚铁叶酸片对贫血,尤其是对妇女妊娠期或产后贫血有良好的恢复作用[1-2]。 复方阿胶浆是一种纯中药制剂,有气血双补的功效,临床上主要应用于治疗各种贫血、经期保健等[3-4]。 石榴补血糖浆以石榴为其主要组成成分,具有补气血的作用,可用于治疗气血亏虚所致的心悸、气短、头晕、贫血、健忘等症。 本研究所用石榴补血糖浆是经国家药监局批准,由新疆维吾尔药业有限责任公司生产。 石榴补血糖浆以酸石榴和甜石榴为主要原料,性味酸、甘,是补血、生血良药。 酸石榴:血液质调节药,降低肝之热,清心安神。 甜石榴:补心药,功能生湿生寒,清热补心,补肝壮阳。 实验中用复方阿胶浆和硫酸亚铁作为对照,采用灌胃的方法,来探讨石榴补血糖浆对血虚证模型大鼠造血功能的影响及其相关机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级 4 周龄 Wistar 雄性大鼠 35 只,体重 160～200 g,来源于湖北省疾控中心[SCXK(鄂)2017-0012]。 无菌手术在武汉华联科生物技术有限公司动物实验中心屏障动物实验设施进行[SYXK(鄂)2018-0104]。 实验经过武汉华联科生物技术有限公司动物实验中心伦理委员会批准(HLK -20181211-01),并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

复方阿胶浆购自东阿阿胶股份有限公司,国药准字Z20083345,批号:1708005;硫酸亚铁购自阿拉丁公司,CAS 号:7782-63-0,批号:lot.#E1815087;石榴补血糖浆购自新疆维吾尔药业有限责任公司,国药准字Z20026094,批号:0180411;EPO ELISA 检测试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司,货号:MU30110;兔抗 SCF 抗体、兔抗 GM-CSF 抗体、兔抗GAPDH 抗体、羊抗兔二抗IgG 购自Thermo 公司,货号分别为:26582-1-AP、PAB34381、PAB36264、PAB160011;BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自bioswamp 公司(货号:PAB180007);SYBR Green PCR 试 剂 盒 购 自 KAPA Biosystems 公 司, 货号:KM4101。

酶标仪:芬兰(Labsystems Multiskan MS)公司产品,型号:352 型;全自动化学发光分析仪:上海天能科技有限公司,型号:Tanon-5200;全自动血液分析仪:美国 MASCOT 公司,型号:HEMAVET 950;荧光定量 PCR 仪: 美国 Bio-Rad 公司, 型号: CFXConnect 96。

1.3 实验方法

1.3.1 动物建模

将大鼠随机分为7 组,1 个对照组和6 个实验组。 对照组喂食普通饲料,实验组喂食低铁饲料,喂食4 周,并辅以少量尾静脉放血(每周放血一次,每次1～1.5 mL)建立缺铁性贫血模型。 6 个实验组分为模型组、石榴补血糖浆低剂量组3.125 mL/(kg·d)、中剂量组 9.375 mL/(kg·d)、高剂量组 28.125 mL/(kg·d)、复方阿胶浆组6.25 mL/(kg·d)、硫酸亚铁组0.27 mL/(kg·d),给药周期为20 d,每天灌胃给药,每10 d采集大鼠全血一次,用于血象指标的检测。 给药结束时,采血分离血清,并采集两侧胫骨。

1.3.2 外周血象分析

在给药的第 0、10、20 天,采血测定血象指标:红细胞数目、白细胞计数,血小板计数,血红蛋白浓度以及红细胞比容。

1.3.3 大鼠骨髓有核细胞分离

依据鄢星等[5]方法,取小鼠双侧股骨,剪开股骨暴露出骨髓腔,用2 mL 培养液冲洗骨髓腔,收集细胞。

1.3.4 ELISA 检测促红细胞生成素(EPO)

96 孔板每孔加血清40 μL,加生物素标记的EPO 抗体10 μL,混匀,再加辣根过氧化物酶结合物,37℃孵育30 min,洗涤5 次,每孔分别加显色液A 和显色液 B 各 50 μL,混匀,37℃孵育 10 min,每孔加终止液50 μL,在酶标仪450 nm 处读数。

1.3.5 Real-time PCR 检测骨髓有核细胞SCF、GMCSF 核酸表达

提取骨髓有核细胞内RNA,逆转录成cDNA,再进行 Real-time PCR 扩增,扩增体系如下:SYBR Green Mix 10 μL,上、下游引物 0.5 μL,cDNA 模板 1 μL,ddH2O 8 μL,总体积 20 μL。 反应程序:95℃,3 min;95℃,5 s;56℃,10 s;72℃,25 s;39 cycles;65℃,5 s;95℃,50 s。 以 GAPDH 作为内参,结果采用 2-△△Ct法进行分析。 引物序列见表1。

1.3.6 Western blot 检测骨髓有核细胞 SCF、GMCSF 蛋白表达

将细胞裂解,离心后取上清进行蛋白质浓度测定。 然后用12%的分离胶,5%的浓缩胶进行蛋白质电泳、90 V 转膜50 min、5%脱脂奶粉封闭2 h、孵育兔抗大鼠 SCF 抗体(1 ∶1000 稀释)、兔抗大鼠 GMCSF 抗体(1 ∶2000 稀释)、兔抗大鼠 GAPDH 抗体(1∶2000 稀释),37℃孵育 2 h,洗涤 3 次,加羊抗兔二抗 IgG(1 ∶20000 稀释)37℃ 孵育 1 h,洗涤 3 次,暗室中与ECL 发光液充分接触,于全自动化学发光分析仪中检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析,结果采用平均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。 使用Graphpad prism 6 软件制作统计图。

表1 Real-time PCR 检测引物序列Table 1 Real-time PCR Primer sequence

2 结果

2.1 石榴补血糖浆对大鼠存活率的影响

饲喂低铁饲料4 周后,大鼠出现精神萎靡,可视粘膜苍白症状。 存活率情况见图1。 在连续给药20 d 后,石榴补血糖浆高、中、低组、硫酸亚铁组和复方阿胶浆组,临床症状消失。 模型组在连续观察期的第2、3、4 天各有一只大鼠死亡;石榴补血糖浆高剂量组在第7 天死亡一只;中剂量组在第5 天死亡一只;低剂量组在第4、5 天各死亡一只;硫酸亚铁组在第3、5 天各死亡一只;复方阿胶浆组在第5 天死亡一只。

2.2 石榴补血糖浆对大鼠血象的影响

石榴补血糖对大鼠的血象的影响情况见图2。红细胞数量显示在第10 天,与模型组比较,对照组、石榴补血糖浆高、中、低剂量组均有显著性差异(P<0.05 或P<0.01);在第20 天,与模型组比较,对照组、石榴补血糖浆高、中、低剂量组均有显著性差异(P<0.05 或P<0.01)。 血红蛋白含量与红细胞比容和红细胞变化趋势基本相同。 在第10 天和第20天,与模型组比较,对照组、石榴补血高、中、低剂量组组血小板及白细胞数量均明显增多(P<0.05或P<0.01)。

2.3 石榴补血糖浆对EPO 含量的影响

第20 天,模型组EPO 含量有明显的上升,而其它组均有一定的降低,其中模型组和对照组、石榴补血糖浆高剂量组有显著性差异(P<0.05)。 详见图3。

注:不同颜色代表不同组小鼠存活率。图1 药物使用后大鼠存活率(n=5)Note.Different colors represent the survival rate of different groups of mice.Figure 1 Rat survival rate after drug use

注:图中各组bar 依次代表分别给药处理10 d 和20 d 后的血象指标。 与模型组比较,∗P<0.05,∗∗P<0.01。图2 不同给药时间点血常规结果(n=5)Note.The each group of bar in the figure represents the blood indicators after 10 and 20 days of treatment respectively.Compared with model group, ∗P<0.05, ∗∗P<0.01.Figure 2 Blood routine results at different time points

2.4 石榴补血糖浆对骨髓有核细胞数的影响

根据血象分析和动物的体征,中剂量组的效果较好,且接近半数有效量(ED50),后续实验选择了中剂量。 与模型组比较,对照组、中剂量组、硫酸亚铁组、复方阿胶浆组有核细胞数量均显著增多(P<0.01)。 详见图4。

2.5 石榴补血糖浆对骨髓有核细胞中SCF、GMCSF 的核酸表达的影响

在骨髓有核细胞中,中剂量组、硫酸亚铁组、复方阿胶浆组SCF 基因表达量均有所上升(P<0.05或P<0.01)。 GM-CSF 基因表达量也呈现相似趋势,中剂量组、硫酸亚铁组、复方阿胶浆组GM-CSF基因表达量均有所上升,其中,模型组与对照组有较显著差异(P<0.01),模型组与中剂量组和硫酸亚铁组有显著性差异(P<0.05)。 详见图5。

2.6 石榴补血糖浆对骨髓有核细胞中SCF、GMCSF 的蛋白表达水平的影响

与模型组相比,对照组、中剂量组、硫酸亚铁组、复方阿胶浆组骨髓有核细胞内SCF、GM-CSF 的表达水平明显升高。 中剂量组与模型组有较显著性差异(P<0.01),且模型组与对照组也有较显著差异(P<0.01)。 详见图6。

3 讨论

治疗血虚证,常用药物有阿胶,黄芪,石榴,复方硫酸亚铁叶酸片等。 本研究用硫酸亚铁和复方阿胶浆作为对照,来探究石榴补血糖浆对血虚症的作用,结果显示,石榴补血糖浆组大鼠存活率有所升高,且死亡时间比模型组靠后,说明石榴补血糖浆能降低大鼠血虚证死亡率。 在用石榴补血糖浆高、中剂量的第10 天和第20 天,红细胞数量和模型组相比有显著性增高(P<0.01),另外对血小板的恢复作用也相当明显,这说明石榴补血糖浆有良好的补血效果,能有效地缓解大鼠的血虚症状,这与李学强等[6]人研究结果一致。 在第20 天,石榴补血糖浆组白细胞数量和模型组相比有显著性增高,这表明石榴补血糖浆能较好地恢复大鼠白细胞数量,有一定的增强免疫的功能。

机体在缺血的情况下,会快速启动骨髓的造血功能,组织学上表现为血细胞前体细胞(幼稚红细胞、多核聚细胞)增多[6-8],在本研究中,石榴补血糖浆组骨髓内有核细胞数有明显的升高,这表明石榴补血糖浆在机体外周血细胞降低的情况下,能有效地促进骨髓造血。 促红细胞生成素EPO,生理功能主要是与红系祖细胞的表面受体结合,促进骨髓内红系定向干细胞分化为红系母细胞、骨髓内网织红细胞和红细胞的释放。 在机体外周血缺少红细胞的情况下,机体会通过负反馈调节机制,来促进机体合成更多的EPO,EPO 作用于骨髓红系祖细胞,进而产生更多的红细胞[9-10]。 邓家刚等[11]人发现,鸡血藤总黄酮可以通过提高血清中EPO 的含量,从而缓解因各种化学因素所致的血虚症状。 在本研究中,模型组红细胞含量明显低于对照组,且模型组EPO 含量有明显的上升,并和石榴补血糖浆高剂量组有显著性差异,这说明高剂量石榴补血糖浆可能通过调节EPO 含量,进而提高大鼠红细胞数量。

注:图中各组bar 依次代表分别给药处理20 d 后的EPO 的含量。 与模型组比较,∗P<0.05。图3 第20 天血清中EPO 含量(n=5)Note.The each group of bar in the figure represents the EPO content in serum on 20th day.Compared with model group,∗P <0.05.Figure 3 EPO content in serum on 20th day

注:图中各组bar 依次代表分别给药处理20 d 后的骨髓有核细胞数。 与模型组比较,∗∗P<0.01。图4 第20 天骨髓有核细胞数(n=5)Note.The each group of bar in the figure represents the number of bone marrow nucleated cells on 20th day.Compared with model group,∗∗P <0.01.Figure 4 Number of bone marrow nucleated cells on 20th day

注:图中各组bar 依次代表分别给药处理20 d 后的骨髓有核细胞中SCF、GM-CSF mRNA 表达。 A:SCF mRNA 相对表达量;B:GM-CSF mRNA 相对表达量。 与模型组比较,∗P<0.05,∗∗P<0.01。图5 骨髓有核细胞中SCF、GM-CSF mRNA 表达(n=5)Note.The each group of bar in the figure represents expression of SCF and GM-CSF mRNA in bone marrow nucleated cells.A, Relative expression of SCF mRNA.B, Relative expression of GM-CSF mRNA.Compared with model group,∗ P <0.05, ∗∗ P <0.01.Figure 5 Expression of SCF and GM-CSF mRNA in bone marrow nucleated cells

注:图中各组bar 依次代表分别给药处理20 d 后的骨髓有核细胞中SCF、GM-CSF 蛋白表达。 A:1:对照组;2:中剂量组;3:模型组;4:硫酸亚铁组;5:复方阿胶浆组;B:SCF 蛋白相对表达量;C:GM-CSF 蛋白相对表达量。 与模型组比较,∗∗P<0.01。图6 骨髓有核细胞中SCF、GM-CSF 蛋白表达(n=5)Note.The each group of bar in the figure represents expression of SCF and GM-CSF protein in bone marrow nucleated cells.A, 1, Control group.2, Medium dose group.3, Model group.4, Ferrous sulfate group.5, Compound donkey-hide gelatin group.B, Relative expression of SCF protein.C, Relative expression of GM-CSF protein.Compared with model group,∗∗P <0.01.Figure 6 Expression of SCF and GM-CSF protein in bone marrow nucleated cells

SCF、GM-CSF 对髓系干细胞到成熟粒细胞的增殖与分化过程均有刺激作用。 丛培玮等[12]发现脾气虚证大鼠模型的外周血象中,红细胞数及SCF 含量均出现明显降低。 王琰等[13]对35 例慢性再生障碍性贫血患者骨髓样本进行分析后发现,患者体内的SCF 水平明显低于正常人。 姚楠等人[14]用加味当归补血汤对血虚证大鼠进行干预后,发现血虚大鼠的EPO 和GM-CSF 的表达量均出现不同程度的升高,红细胞和血红蛋白数量明显增加。 因此,EPO,SCF,GM-CSF 均可正向调控造血,表达量减少,则会出现造血调节因子不能充分促进骨髓造血而导致贫血,而表达增加则促进骨髓造血,进而增加血细胞生成,增加血管中的血容量[15-20]。 本研究中,石榴补血糖浆组和模型组相比,SCF、GM-CSF 表达量均有明显升高,这表明石榴补血糖浆能增加大鼠SCF、GM-CSF 表达量,进而促进骨髓造血,产生大量的血细胞,用于恢复外周血细胞数量,这也可能是石榴补血糖浆恢复机体血细胞水平的主要机制之一。

综上所述,石榴补血糖浆可缓解血虚症的临床症状,增加血细胞数量和红细胞比容,促进造血功能相关的细胞因子EPO,SCF,GM-CSF 的表达,且可以提高骨髓有核细胞数量,提示石榴补血糖浆可能通过提高造血细胞因子EPO,SCF,GM-CSF 的表达量来改善血虚证模型大鼠的造血功能。