基于极大似然法的超分辨荧光显微成像方法研究

张赛文，曹艳青*，冷潇泠，谭伟石

(1. 湖南城市学院 信息与电子工程学院，湖南 益阳 413000；2. 全固态储能材料与器件湖南省重点实验室，湖南 益阳 413000)

细胞与亚细胞水平的生物学过程知识大多来自于直接的可视化方式.而在各种各样的显微技术中，荧光显微技术由于具有可以通过分子特异性标记来观察特定的细胞成分和实时观察活体样品内部的结构2 个主要优势而被广泛应用.在荧光显微技术中，单分子定位是一种极具代表性的超分辨荧光成像方法[1].定位超分辨成像技术是把荧光分子图像通过高精度的分子定位算法重建成超分辨图像，达到20～30 nm 超高空间分辨率，可以为生物医学等方面的研究提供极其宝贵的数据[2].荧光标记，如荧光蛋白和量子点，已经成为生物学中一种宝贵的工具，它们可以研究活细胞和有机体的分子动力学与相互作用[3].随着荧光标记技术和先进的荧光成像技术的出现，特别是来源于荧光显微镜的超分辨率成像技术[4]，人们现在可以深入了解具有高时空分辨率的活细胞的动态过程[5].然而，衍射极限的存在使 2 个物点的像相互靠近后不能很好地进行区分，因此限制了系统的分辨率[6].依赖单个荧光分子探针的检测和定位来重建超分辨图像的光激活定位显微术(Photoactivated Localization Microscopy, PALM)[7]以及随机光学重建显微术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)[1,8]，可以克服上述缺点，其分辨率不受远场衍射的限制.

在低密度荧光分子图像的单分子定位中，最简单的方法就是采用质心定位算法[9]，此方法计算速度快，但是定位精度不高.最为广泛采用的方法是高斯函数进行最小二乘拟合，此方法精度高，但计算速度慢[1,8,10].还有学者把点扩展函数转换到频率域中进行计算，提高了计算速度，实现了在超分辨荧光成像中的应用[11-12].极大似然法(Maximum Likelihood Estimation, MLE)在超分辨图像的重建中也有大量应用[13-17].在采用MLE 算法实现荧光分子定位时，利用点扩展函数(Point Spread Function, PSF)的可分离特性，可以显著减少重构时间[16].为了同时实现多个分子定位，有人对极大似然法进行了改进，采用了计算科学里著名的分而治之策略，提出了一种基于拟合的方法(QC-STORM)，可以快速实现多个分子定位[18].为了提高重构荧光分子图像的密度，出现了一系列方法，如采用结构稀疏模型与贝叶斯信息判据的方法[19]、采用压缩感知的方法[20-24]和深度学习算法[25]等.

本文根据点扩展函数理论[12]和荧光成像技术，采用 MATLAB 软件模拟生成随机分布的荧光分子图像.首先，对模拟的荧光图像和实际生物样品图像进行解卷积降噪和二值化去背景，以提取单个分子所在区域的图像；其次，建立极大似然模型，并通过 MATLAB 优化工具箱对提取的图像进行定位以验证算法的可行性；最后，通过模拟生成有结构的样品生物图像和实际的生物样品图像，采用本文所提算法对每一帧图像进行定位，以实现超分辨图像的重构.

1 单分子定位方法

1.1 成像原理和点扩散函数理论

PSF 被广泛应用于描述处于焦平面的独立荧光分子的光学系统成像，该函数可以近似采用二维的高斯函数代替[26]，即

其中，A 表示幅度，即信号峰值的强度；b 为信号附加的噪声；σ 是高斯核函数的宽度.

在 STORM 成像中，假设每个辐射源(分子)发光都是独立的，即强度属于非相干叠加，那么多个分子发光所成的像是由点扩展函数与分子的荧光强度分布函数卷积而成[20].因卷积可以写成求和的形式，所以观测信号[19,27]可表示为

1.2 极大似然模型

目前，极大似然法是一种被广泛应用的统计方法[14-15,28]，其基础是最大似然估计原理.极大似然法为给定的参考数据提供了一种评估模型函数，即“模型已定，参数未知”.通过多次试验的观察和对比，最终发现能够使样本呈现的概率为最大化某个参数值的试验结果.

在已知荧光分子的辐射模型的基础上，极大似然法(MLE)可以通过调整模型函数中的参数(包括荧光分子的位置)，来得到最大光强的空间联合分布.若假设像素(i, j) 处检测到q 个光子的概率为

2 模拟结果与讨论

2.1 随机荧光分子图像的模拟和定位

根据荧光显微成像原理，让每个荧光分子发射的光子数服从对数正态分布，其峰值为 5 000光子数，标准差为2 000 光子数；设置物镜的数值孔径为1.2，发射波长λ 为660 nm，有效像元尺寸为100 nm；模拟生成荧光图像后，每个像素添加70 个光子数的背景噪声并进行泊松化[30]；每个荧光分子经过光学系统后生成的图像对应一个二维的高斯函数，模拟生成的50 个荧光分子随机分布在像元数为128×128 pixels 图像上，结果如图1 所示.

图1 模拟生成的荧光分子图像

为了定位所有荧光分子的位置，需要对荧光分子图像进行预处理.首先，采用解卷积算法消除部分高斯白噪声；然后，采用二值法清除背景噪声，结果如图2(b)所示.根据PSF 所占像素的个数，取出比PSF 更大的区域(此模拟实验图像大小为7×7 像素)，并采用极大似然法对子区域进行分析和定位，将结果以坐标形式显示并存储，其提取区域和定位图像如图 2(c)所示(坐标位置用“+”显示).从图 2(c)中可以看出，当分子比较稀疏时，可以精确定位；当荧光分子靠得比较近时，则会影响旁边的荧光分子的定位精度.所以，在用激光激发荧光分子时，应尽量使分子稀疏分布，以提高定位精度.进一步将分子定位坐标反馈到原图像进行对比，结果如图2(d)所示.

图2 随机荧光分子的定位

2.2 有结构的荧光分子图像模拟和定位

为了验证极大似然法可以实现超分辨荧光图像重构，模拟生成10 条荧光分子带，每2 条分子带间的距离分别为20，50，100，200 和400 nm，其图像大小为64×64 个像素，像素的有效像元尺寸为100 nm×100 nm.为了让荧光分子处于稀疏状态(即尽量不重叠)，让每帧图像都只有 8 个分子随机分布在其上.根据点扩展函数理论，生成的其中1 帧图像如图3(a)所示；对每个荧光光斑提取其子区域，如图 3(b)方框所示，进一步对子区域用极大似然法进行精确定位，如图 3(b)方框内红点所示；生成随机分布的荧光分子图像5 000帧，共40 000 个分子，对5 000 帧图像直接累加生成的宽场图像如图 3(c)所示；对每帧图像单独进行定位，并且记录其中每个荧光分子的位置坐标(为了将坐标用图像进行显示，对每个像素进行10 倍细分，坐标落入细分像素里的分子，其灰度值加1)，结果如图3(d)所示.

图3 荧光分子条带的定位

与图 3(c)对比，可以看出图 3(d)的分子条带分辨率明显有了很大的提高.取图 3(c)～(d)中 y方向的灰度图像进行对比，结果如图4 所示.

图4 图3(c)～(d)中y 方向的归一化强度分布

从图4 可以看出，宽场图像离得较近的3 条分子条带无法分辨.2 条分子带的间距＜100 nm时，宽场图像不能分辨；分子带的间距＞200 nm时，虽有2 个峰，但是分辨能力不强；而采用极大似然法进行定位，当分子带间距接近20 nm 时，也可以区分，如图4 中左边虚线的2 个峰值.

为了进一步验证极大似然法的性能，让荧光分子分布在2 个靠近的圆环上，图像大小和每帧荧光分子数同模拟荧光分子条带一样，光学系统参数与2.1节相同.模拟生成的5 000帧荧光分子图像的累加宽场图像如图 5(a)所示，图中比例尺为1 μm.从图5(a)可以看出，当2 个圆环比较靠近时，无法进行分辨.采用极大似然法对每帧荧光分子图像进行定位，每个定位的荧光分子坐标采用荧光分子条带的结果显示方法显示，如图5(b)所示.从图 5(b)可看出，圆环变得更细、更清晰，在图 5(a)中不能分辨的地方，也可以予以区分.

图5 2 个靠近圆环上的荧光分子定位

为便于比较，取图 5(a)～(b)中竖线所示图像的灰度值进行对比显示，结果如图6 所示.图6中点实线代表从宽场图像中取出的灰度值，虚线代表从超分重构图像中取出的灰度值.

图6 图5(a)～(b)中竖线位置的归一化强度分布

从图6 可以看出，在宽场图像中不能分辨的位置，在虚线中可以清楚地看到2 个峰，这说明分辨能力得到了明显提升.

3 实验结果与讨论

为了验证算法的实用性，从国外的公开网站(http://bigwww.epfl.ch/smlm/datasets/index.html?p=tubulin-conjal647)上获取13 000帧由光学系统采集的长序列实验图像，每帧图像都是稀疏分布，确保定位能够准确.对获取的所有图像取其大小为100×100 像素，对这13 000 帧图像进行累加的宽场图像如图 7(a)所示.为使重构结果更加清晰，对定位后重构的结果取对数进行显示，如图7(b)所示.

图7 实际生物样品的定位重构

从图 7(b)可以看出，分辨率有了很大提高，在宽场图像中不能分辨的2 条微丝，经过重构处理后，可以明显区分.为了进一步比较，取图7(a)～(b)中横线位置的灰度值进行对比，结果如图8所示.图8 中点实线代表从宽场图像中取出的灰度值，虚线代表从超分图像中取出的灰度值.

图8 图7(a)～(b)中横线位置的归一化强度分布

从图 8 可看出，宽场图像(点实线)只有 1 个峰，而重构图像(虚线)有2 个峰值，可以分辨.

4 结论

采用极大似然法可以实现单分子定位，并获得超分辨荧光图像.本研究分别对模拟的分子条带和2 个相邻圆环的结构样品，以及实际生物样品进行了分子定位，并且实现了超分辨荧光图像重构.结果显示，图像分辨率均得到了显著提高，这说明此方法具有一定的实用价值.然而，此方法也存在一定的局限性，即当分子密度足够高时，荧光分子图像就会发生重叠，从而导致单个分子图像的区域无法准确提取和定位.