非小细胞肺癌患者铂类药物化疗前后RMB5基因表达的变化及化疗预后分析

林杰勋 徐象威 张鹏海 朱佩祯 陈银巧 奚一源

肺癌是我国发病率和病死率最高的一种恶性肿瘤，一项调查报道2015年约有733 300例新发的肺癌病例和610 200例死亡病例[1]。其中非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）仍是我国肺癌的主要类型，且常在发现时就已处于晚期。尽管近年来手术方案不断革新，靶向治疗、免疫治疗不断应用于临床，但是其5年生存率仍不足17%[2-3]。特别对于鳞癌及EGFR基因未突变的患者，含铂类药物化疗方案仍是晚期NSCLC的一线抗肿瘤治疗方案之一[4]。铂类化合物与细胞核内DNA结合，形成DNA-铂类配合物引起DNA损伤，从而诱导肿瘤细胞的凋亡。但是由于肺癌对铂类药物的天然耐药或继发性耐药可对药物的临床疗效和患者的远期预后造成严重影响。已有研究表明，凋亡缺陷是肿瘤细胞对顺铂产生耐药的主要机制之一[5]。有研究发现，RBM5基因是人体内一种重要的抑癌基因，在诸多肿瘤细胞中，RBM5调控许多基因的mRNA前体的选择性剪切，可以调控细胞分化、细胞周期以及细胞凋亡等细胞代谢过程，与肿瘤的发生、发展关系密切[6-7]。外源性高表达RBM5可以促进肿瘤细胞的凋亡及G1期周期阻滞，抑制肿瘤细胞的增殖，逆转肺癌耐药。当前对于RBM5的研究多为体外基础研究，本研究从临床实际病例中分析NSCLC患者铂类化疗前后RBM5 mRNA表达情况，评估其与化疗疗效以及无进展生存期（progression-free survival，PFS）的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年2月至2017年8月永康市第一人民医院肿瘤内科收治的接受含铂类药物化疗方案的晚期NSCLC患者52例，其中男37例，女15例，年龄43～78（64.35±8.92）岁。纳入标准：（1）年龄 18～80 岁；（2）入组前均经气管镜或经皮肺穿刺或胸水及痰查脱落细胞学明确病理类型的NSCLC患者，经CT、MRI检查证实具有一处及以上可测量肿瘤病灶，可根据国际抗癌联盟TNM分期进行分期；（3）EGFR基因未见突变，未使用靶向治疗药物；（4）治疗方案均以铂类化疗药物为主的联合化疗，且化疗至少4个周期的患者；（5）患者心电图、肝肾功能检查正常，均能达到化疗的基本要求，预计生存期＞3个月，Karnofsky功能状态评分≥60分。排除标准：（1）同时具有2种以上原发肿瘤患者；（2）曾接受放射治疗或手术治疗患者；（3）严重肝肾、心功能不全患者。剔除标准：（1）研究期间发生严重不良事件、并发症和特殊病情变化不宜继续接受调查者；（2）患者或家属不愿继续配合并退出者。所有患者均签署书面知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法 于患者入院时记录一般资料，包括性别、年龄、吸烟史、饮酒史、肿瘤类型、临床分期、体力活动状态（performance status，PS）评分等。所有患者确诊后均给予标准的含铂类联合化疗方案，包括长春瑞滨+顺铂、紫杉醇+顺铂/卡铂、吉西他滨+顺铂/卡铂、多西他赛+顺铂/卡铂、培美曲赛+顺铂/卡铂。通过评估患者血常规、肝肾功能、心电图等检查结果，确认患者化疗耐受性，当接受铂类化疗的患者出现疾病突然恶化或患者无法承受化疗药物毒性时，铂类化疗即时终止。进行4个周期化疗后，通过肿瘤标志物、B超、胸部CT或MRI等检查评估患者化疗疗效。疗效按实体瘤标准判定[7]：分为完全缓解（CR），部分缓解（PR），无变化（SD），疾病进展（PD）。其中有效率（RR）＝[（CR+PR）/（CR+PR+SD+PD）]×100%，稳定率（CBR）＝[（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）]×100%。患者经铂类化疗后表现为CR或PR被定义为高反应（17例），SD或PD被定义为低反应（35例），两组患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史、肿瘤类型、临床分期、PS评分比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。同时，抽取患者初次化疗前及化疗4个周期后静脉血，置于-70℃超低温冰箱保存。

表1 两组患者一般资料对比（例）

1.2.1 RBM5 mRNA表达量检测 采用qRT-PCR法。总RNA的提取采用RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒（北京天根生化有限公司，批号：Q5812）。采用反转录试剂盒（中国 Thermo Fermentas公司，批号：00314979）将RNA逆转录合成第1条链。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成：P1:ACACGATGGATGGAAGCCA；P2:TCTGCTCTGCCTCTGACTT。按照 KAPA SYBRRFAST Real-time PCR Kit的反应体系于ABI 7300 qPCR仪上完成基因检测。以β-action为内参，采用相对定量法（ΔΔCt）对实时荧光定量PCR产物进行比较。公式如下：ΔCt=Ct均值（目的基因）－Ct均值（管家基因），ΔΔCt=实验组 ΔCt－对照组 ΔCt，差异倍数=2-ΔΔCt。

1.2.2 预后情况评估 采用电话随访、门诊或住院病历系统查询等方式。研究主要观察终点为PFS，定义为自首次化疗后至随访终止或疾病复发或转移的时间，主要通过医院信息系统或患者直系亲属电话确认，末次随访截止2018年10月31日。患者在化疗疗程结束后每2个月随访1次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以表示，化疗前后比较采用配对t检验，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者化疗疗效评价 52例患者经过4周期化疗后，通过B超、肿瘤标志物、胸部MRI等检查评估患者化疗疗效。其中CR 4例，PR 13例，SD 18例，PD 17例。治疗4周期后，RR为32.69%，CBR为67.30%。

2.2 不同疗效及高反应、低反应组患者化疗前后RBM5 mRNA表达量比较 不同疗效组患者化疗前RBM5 mRNA表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。化疗后，CR组、PR组RBM5 mRNA表达量均明显高于化疗前，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而PD组患者RBM5 mRNA表达量明显低于化疗前，差异有统计学意义（P＜0.01）。化疗后各疗效组比较差异有统计学意义（P＜0.01），且SD、PD组 RBM5 mRNA表达量均明显低于CR、PR组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表2。

高反应、低反应组患者化疗前RBM5 mRNA表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。化疗后，高反应组RBM5 mRNA表达较化疗前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），而低反应组RBM5 mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），且高反应组RBM5 mRNA表达明显高于低反应组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表3。

表2 不同疗效患者化疗前后RBM5 mRNA表达量比较

表3 高反应、低反应组患者化疗前后RBM5 mRNA表达量比较

2.3 NSCLS患者化疗后不同疗效及高反应、低反应与PFS的关系分析 按照化疗后疗效情况，分析不同疗效患者的生存曲线，CR组患者中位PFS为8.35个月，PR组患者为7.80个月，SD组患者为6.70个月，PD组患者为6.80个月，4组比较差异无统计学意义（χ2=6.257，P＞0.05），见图1。按照化疗后反应情况，分析化疗高、低反应患者的生存曲线，高反应组与低反应组的中位PFS分别为7.8个月与6.7个月，两组比较差异有统计学意义（χ2=5.796，P＜0.05），见图 2。

3 讨论

铂类药物作为治疗肺癌最有效的一线化疗药物，使用率达40%，其主要作用于细胞DNA、RNA和蛋白质，属于细胞周期非特异性药物[8]。多数患者在化疗初期对化疗药物敏感，肿瘤体积缩小，临床症状减轻，但随着化疗周期的增多，临床疗效逐渐不佳，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性[9]。近年来，已有研究发现铂类药物对DNA产生不可修复的损伤可激活凋亡通路杀灭肿瘤细胞，细胞凋亡信号传导通路中的任何环节功能受抑制或失活均能够诱导肿瘤细胞对铂类药物产生耐药性[10]。

图1 不同疗效患者的生存曲线比较（CR为完全缓解；PR为部分缓解；SD为无变化；PD为疾病进展）

图2 高反应、低反应患者的生存曲线比较

RBM5，又称为Luca15或H37，其基因定位于染色体3p21.3区域，是近年来发现的抑癌基因，与肺癌密切相关[11]。在多种恶性肿瘤细胞中（特别是肺癌），RBM5通过调控mRNA前体的选择性剪切，介导细胞凋亡与促凋亡蛋白表达上调、抗凋亡蛋白表达下调、线粒体细胞色C素释放进入细胞液增加和caspase家族活化增加，也可调节其他多种细胞内信号转导和生物学行为[12-13]。邵晨[14]研究发现，肺癌组织上RBM5呈现低表达，且凋亡抑制蛋白表达明显增高。同时通过对肺腺癌的体内、体外实验研究证实，RBM5可通过诱导细胞凋亡及抑制细胞增殖的共同作用来抑制肺腺癌生长。当前关于RBM5在肺癌组织上的表达及其功能方面的研究目前仅有少数报道，且多数局限于细胞株上的研究。在多种恶性肿瘤细胞株中，过表达RBM5可抑制细胞凋亡，并通过使细胞周期停滞在G1期来抑制细胞增殖[15-16]。在Su等[17]研究中RBM5在其耐药细胞A549/DDP中表达下调，而RBM5基因导入该细胞株后，其对顺铂的敏感性显著增加。在Loiselle等[18]研究中也发现了RBM5可以降低小细胞肺癌的生长，增加顺铂的敏感性，并调节关键的转化相关通路。本研究从临床实际病例中分析NSCLC患者铂类化疗前后RBM5 mRNA表达量情况，评估其与化疗疗效以及生存期间的关系，通过对比不同化疗患者化疗前RBM5 mRNA表达情况发现，疗效为CR、PR的患者RBM5 mRNA表达量较化疗前有升高，而SD、PD的患者较前下降。同时生存情况，CR组中位PFS最高，但由于例数太少，导致与SD、PD组比较差异无明显意义，而化疗高反应组中位PFS明显长于低反应组，说明化疗越好，患者生存时间越长。

综上所述，NSCLC患者经铂类化疗后，不同患者对铂类药物具有不同的敏感性，从而出现不同的疗效及预后，化疗疗效好的患者RBM5 mRNA呈现高表达，且生存期较长。铂类药物可诱导NSCLC患者RBM5 mRNA表达的改变，检测其表达量对于判断NSCLC患者化疗效果与预后具有一定的参考价值。在今后的研究中可对RBM5对肿瘤耐药的调控机制进一步研究，以期为今后临床开展克服肿瘤多药耐药提供更多依据。