新型多焦点结构光显微成像技术

耿金华，龙志军，张 炜

（佛山职业技术学院，广东 佛山 528137）

1 引言

共聚焦激光扫描显微镜是生物成像领域中被广泛使用的成像设备[1-2]，能够在荧光样品（细胞或组织）成像时获取到层析图像。在成像过程中，使用单个激光焦斑对样品进行逐点扫描，再利用针孔有效地去除离焦信号。这种逐点扫描方法限制了成像速度，难以用来观测活体标本的动态变化。相比之下，MSIM通过快速投射多个离散的光斑进行扫描，使用CCD相机捕捉多焦点图像，从而获得更高的成像速度[3-5]。通过对这些多焦点图像添加数字针孔、重定位运算及叠加处理，MSIM可以在1 Hz的帧速下获得空间分辨率大幅提升（超过衍射极限）的层析图像[3]。在传统的MSIM系统中，通常使用针孔阵列来抑制散射光和离焦荧光信号，但是无法消除深层的离焦信号，导致成像结果中出现明显的背景信号[6]。DUSSAUX等人为了抑制这种离焦信号而提出一种多点扫描差分共焦成像技术[7]。该方法采用图像差分的方式消除背景信号，在抑制离焦信号的同时也会降低成像结果的信噪比（SNR）。

针对现有MSIM技术中使用针孔阵列无法滤除深层离焦信号的问题，本文将层析能力更强的方差层析成像方法与重定位算法结合，实现MSIM层析-超分辨成像。这种改进的MSIM方法将具有较高分辨率的重定位图像和具有层析效果的方差层析图像结合起来，在分别提取方差层析图像的低频频域分量和重定位图像的高频频域分量之后进行叠加，可以得到同时具有这两种图像优势（高分辨率及层析能力）的层析-超分辨图像。

2 成像原理

2.1 重定位算法

MSIM在成像过程中采集多焦点扫描图像。由于荧光分子的实际位置在激发点标称中心和探测位置的中央区域，因此可让每个像素的荧光强度信息向光斑中心移动一半的距离，并将位移后的图像叠加，获得突破衍射极限的横向分辨率[8-9]。使用重定位算法获得超分辨图像之后，图像的光学传递函数（OTF）可以简单地描述为：

如（1）式所示，重定位图像的OTF支撑范围约是普通宽场图像OTF的两倍。这意味着重定位图像具有两倍的横向分辨率。具有两倍分辨率的理想显微镜OTF可以表示为。相比之下，重定位图像OTF中的高频分量幅值较低。针对这个问题的直接解决方案是使用权重函数进行加权处理，进而获得理想的图像OTF分布。使用的权重函数如下所示：

式中，ε为一个数值较小的归一化参数，它应该比最大频域幅值小一个或多个数量级，可以防止在傅里叶空间放大高频图像噪声。

2.2 方差层析成像方法

使用针孔阵列进行并行探测，在扫描厚样品时会产生明显的图像背景。笔者针对该问题提出了一种方差层析成像方法[6]。该方法充分利用MSIM原始多焦点图像的统计特性，可以有效地抑制深层离焦荧光信号。利用移位的多点照明模板pi照射样本，采集到的对应MSIM图像Ii可以表示为：

式中，Iin和Iout分别为聚焦荧光信号和离焦荧光信号分量；μ1和μ2为调制深度；x为图像平面上的位置。

通常情况下，离焦荧光分子的发射光会在焦平面上占据更大的面积，但是荧光强度比位于聚焦层面上荧光分子的发射光要弱。即使对一组相同的位移照明图案进行照射，聚焦层面荧光分子在焦平面上的强度波动也可能比离焦荧光分子的发射光要更大。因此，可以通过计算MSIM原始多焦点图像的方差来得到有效抑制离散荧光信号Iout的方法。如下所示：

式中，V为信号方差。为避免因样品本身亮度不均匀对成像结果的影响，在实际成像过程中通过计算标准差来获得所需的层析图像IOS。

2.3 层析-超分辨成像方法

现有MSIM技术通常采用数字针孔阵列来抑制离焦荧光信号，随后对这些处理后的MSIM图像进行重定位运算，最终得到层析-超分辨图像。由于针孔阵列很难抑制深层离焦荧光信号，用该方法进行厚样品成像时会在成像结果中看到明显的背景信号，增加了分辨目标精细结构的难度。为了克服现有MSIM技术中存在的问题，本文提出了一种改进的MSIM层析-超分辨成像方法。该方法将方差层析成像方法和重定位算法结合，同时具有方差层析方法在层析成像能力上的优势和重定位算法在提升图像分辨率方面的优势。

在改进的层析-超分辨方法中，通过对同一组采集的MSIM原始多焦点图像数据进行处理，可以分别计算得到方差层析图像和重定位超分辨图像。通过分析可知，超分辨图像意味着获得超越衍射极限的高频信号分量，而层析能力的提高则意味着已经有效去除了低频离焦背景信号。因此，在频域内将方差层析图像的低频分量与重定位超分辨图像的高频分量合并，可以得到增强的MSIM层析-超分辨图像。结合层析图像和超分辨图像频率信息的计算方法如下所示：

式中，L和H分别为频域的低通滤波器和高通滤波器，并且可以定义为：

式中，uWide为普通宽场图像的OTF截止频率。

这种通过组合频域分量获取层析-超分辨图像的方法首先在结构光显微成像技术中得到应用[10]。该方法首次在MSIM成像领域应用，用于大深度范围获取层析-超分辨图像。相比于采用结构光显微成像技术，MSIM技术通过投射稀疏的多焦点图案激发样品，在进行大厚度样品成像时受离焦荧光信号影响更小，更容易获得更高对比度的图像。因此，MSIM技术可以获得比结构光显微成像技术（小于10 μm）更高的成像深度（高达 50 μm）[3]。可以看出，本文提出的改进MSIM方法更适合于进行厚样本三维结构的清晰观测。改进MSIM方法的详细步骤如图1所示。

3 仿真

本文通过数值模拟数据对改进MSIM方法的可行性和性能提升效果进行了验证。在数字模拟实验中，在物镜焦平面和离焦平面分别放置一个薄轮辐状分布样品和一个均匀分布样品，其中焦平面与离焦平面之间的距离为3μm，物镜的数值孔径为1.45（NA=1.45），荧光发射光波长为510nm（λem=510nm），图像像素大小设置为43nm。为了评估理想条件下的性能改进效果，本文没有在MSIM原始图像中引入噪声。

图2a-d所示分别为通过数值仿真方式获取的宽场图像、方差层析图像、重定位超分辨图像和层析-超分辨图像。由于存在离焦荧光信号，在宽场图像（图2a）中可以观测到明显的背景信号，该信号导致图像模糊。相比之下，方差层析方法具有较为理想的层析成像能力，可以有效抑制离焦荧光信号，其成像结果（图2b）具有更高的图像对比度。通过比较图2a-d中的虚线圆半径可以看出，重定位超分辨图像和层析-超分辨图像的分辨率要明显高于宽场图像，并且层析-超分辨图像的对比度要优于重定位超分辨图像。为了能够量化评估性能、提升效果，本文计算了与波长周期相关的对比度曲线，如图2e所示。与宽场图像的空间分辨率（226nm）相比，重定位超分辨图像和层析-超分辨图像（136nm）可以将分辨率提升约1.66倍。此外，方差层析图像的分辨率也有一定的提升（187 nm）。

4 结论

笔者提出了一种改进多焦点结构光显微成像的方法，该方法在频域内将方差层析图像与多焦点结构光超分辨图像结合，实现多焦点结构光层析-超分辨成像。与现有多焦点结构光技术相比，该方法可以同时获得理想的离焦荧光信号抑制能力和分辨率成像能力，适用于进行厚样品的精细三维结构重建。