骨化三醇对糖尿病肾病大鼠尿液Smad1 水平的影响

兰 凯，张光伟，刘树义，张旭东，田 甜

（西安医学院临床医学院，陕西 西安 710021）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，近年来我国糖尿病发病率不断增长。糖尿病肾病初期症状不明显，容易造成漏诊，一旦发展到终末期肾病就必须依靠肾脏替代治疗来维持，因此早期诊断及治疗成为学者关注的焦点。有研究显示[1]，骨化三醇具有减轻糖尿病肾病大鼠蛋白尿及肾脏保护作用，但具体影响机制尚不清楚，可能与减轻肾小球系膜基质增生有关，目前这方面的研究较少。近年来研究发现在肾脏疾病发生发展过程中Smad1 蛋白发挥信号传导作用，被认为是糖尿病肾病肾损伤的标志物，其可直接调节肾小球基底膜Ⅳ型胶原等关键纤维化因子的转录活性，从而可能影响到蛋白尿的发生[2，3]。本研究拟通过骨化三醇对糖尿病肾病大鼠尿液信号蛋白Smad1 水平的影响及尿蛋白改变情况，探讨该药物对肾脏保护作用的可能机制，为糖尿病肾病的诊治提供新的思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 购入清洁级封闭群雄性SD大鼠30 只，体质量（200±20）g，均普通饮食喂养。采用随机数字表法将其分为骨化三醇组（T 组）、DN组（D 组）和对照组（N 组），每组10 只。大鼠进行糖尿病肾病造模，剩余10 只大鼠为健康对照组（N组）。本研究严格按照我国实验动物伦理的要求进行，所有动物实验均按照西安医学院伦理委员会的指导方针进行，并经西安医学院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的构建 T 组和D 组大鼠禁食10 h后，予链脲菌素（美国Sigma 公司）单次无菌经腹腔注射，60 mg/kg，健康对照组给予腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液，常规饮食喂养，检测血糖。72 h 后T组和D 组分别取大鼠尾静脉血检测空腹血糖（FBG），FBG≥16.65 mmol/L 确定糖尿病大鼠造模成功，正常饮食喂养3 周后留尿检测24h 尿蛋白量≥30 mg 确定为糖尿病肾病大鼠。T 组将骨化三醇（上海罗氏制药公司，规格0.25 μg/粒，批号J20190056）溶于花生油，以0.03 μg/（kg·d）的剂量进行灌胃治疗；D 组和N 组均给予等量的花生油灌胃。

1.2.2 血、尿指标检测 12 周后所有大鼠代谢笼收集24 h 尿液，记录24h 尿量和饮水量，进食8～10h 后称重，用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉，腹主动脉采血4～5 ml，立即送检。24h 尿蛋白采用双缩脲法检测，依照试剂盒（美国R&D 公司试剂盒）操作流程，采用酶联免疫吸附试验（ELISA） 测定大鼠尿液Smad1 蛋白水平；自动生化仪（美国Glamour 生化仪）检测空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、血钙、血磷和甲状旁腺激素（PTH）。

1.3 观察指标 比较治疗12 周后各组24h 尿蛋白含量、尿Smad1 蛋白水平、血肌酐、血钙、血鳞、空腹血糖及PTH。分析尿液Smad1 水平和24h 尿蛋白量相关性。

1.4 统计学处理 所有数据采用SPSS 19.0 软件包进行统计学分析。计量资料数据采用（）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSDt检验。两变量之间相关性描述采用直线相关性分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗12 周后各组大鼠血指标比较 T、D 组空腹血糖、肌酐和PTH 均高于N 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；T 组肌酐低于D 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；T 组血钙、血磷与N 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 治疗12 周后各组大鼠血指标比较（）

表1 治疗12 周后各组大鼠血指标比较（）

注：与N 组比较，aP＜0.05；与P 组比较，bP＜0.05

2.2 治疗12 周后各组大鼠尿液Smad1 水平和24h尿蛋白量变化情况 T 组和D 组尿液中的Smad1 水平及24h 尿蛋白高于N 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；T 组尿液中Smad1 水平及24h 尿蛋白低于D组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 治疗12 周后各组大鼠尿液smadl 水平和24 h 尿蛋白量变化比较（）

表2 治疗12 周后各组大鼠尿液smadl 水平和24 h 尿蛋白量变化比较（）

注：与N 组相比，aP＜0.05；与P 组相比，bP＜0.05

2.3 尿液Smad1 水平和24 h 尿蛋白量相关性 糖尿病肾病大鼠尿液中Smad1 蛋白水平和24h 尿蛋白量呈正相关（r=0.671，P＜0.05）。

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病病人最为常见的慢性微血管特异性并发症，糖尿病肾病发病率呈逐年上升的趋势，已成为导致临床终末期肾病的主要病因之一[4，5]。由于该病患者机体存在复杂的代谢紊乱，往往要比其它肾脏疾病治疗起来更加棘手。研究发现糖尿病肾病发病包括糖的高代谢异常、肾组织氧化应激及肾脏血流动力学改变等因素，均可引起肾小球滤过膜的损伤，最终导致患者蛋白尿的发生，而微量蛋白尿被广泛认为就是糖尿病肾病的早期标志[6，7]。临床上患者出现持续性蛋白尿说明肾脏可能已经发生的实质性损害。蛋白尿目前已被证实是肾脏损伤的独立危险因素，有效控制蛋白尿可以延缓糖尿病肾病肾脏功能减退，是目前研究治疗的一个突破口。

近来多项研究发现维生素D 具有除调节体内钙磷代谢以外更广泛的生理作用，其还可能影响免疫、生殖、内分泌、神经等生理活动的调节。活性维生素D 是一种脂溶性维生素，其通过影响细胞内介导特异维生素D 受体（vitamin D receptor，VDR）发挥生物学活性[8，9]。维生素D 类似物的分子结构同活性维生素D 相似，可以和VDR 结合通过结构修饰改变产生生物学效应，具有与活性维生素D相似的生物学活性，目前主要包括骨化三醇、帕立骨化醇和度骨化醇等[10，11]。骨化三醇作为维生素D类似物中临床应用最为广泛的一种，前期的研究主要集中在其调节钙磷代谢及治疗佝偻病等方面的作用，近年来有关骨化三醇可能参与肾脏保护作用的研究越来越多。

本研究发现在骨化三醇治疗12 周后糖尿病肾病大鼠蛋白尿指标较未治疗组明显下降，肌酐水平也有下降，尿液中的Smad1 蛋白水平较未治疗组有所下降，证实了其具有独立于钙磷代谢以外的肾脏保护作用，推测骨化三醇可能具有影响信号蛋白Smad1 的作用。Smad 蛋白家族被证实是一类细胞内的信号传导蛋白，其可将TGF-β 信号通路信息从受体传导至靶向细胞内核中，并可在多种靶向细胞种类中发挥重要作用，如调节细胞的分化凋亡，合成基质等，同时也参与免疫调节和组织修复[12，13]。有研究发现，Smad1 蛋白作为Smad 蛋白家族一员是TGF-β1下游重要的信号传导因子，在糖尿病肾病整个病程的进展中发挥着重要的调节作用，可促进足细胞线粒体NADPH 氧化酶增多，抑制了线粒体的功能，诱导肾小球的肥大、形状的改变，甚至细胞凋亡，最终可引起肾小球硬化，造成肾脏功能的持续恶化，导致患者进入终末期肾病[14-16]。研究发现骨化三醇不仅具有调节钙磷代谢的生物学作用，还可能通过影响炎症因子分泌、改善系膜细胞增殖、抑制RAS 系统、减少细胞外基质沉积等途径改善糖尿病肾病病理生理过程，具有独立于钙磷代谢以外的肾脏保护作用[17-19]，但其具体作用机制尚不完全清楚。有研究表明[20,21]，骨化三醇可能通过调节细胞内核因子κB 通路，影响其下游的炎症因子表达减少，抑制炎症反应，进而缓解肾脏组织炎症损伤及肾小球纤维化的进展，从而对改善肾脏功能起到一定的保护作用，与上述研究结果是一致的。同时本研究发现糖尿病肾病大鼠尿液中Smad1 信号蛋白水平和24 h 尿蛋白量成存在正相关趋势，这也说明了Smad1 信号蛋白可以影响糖尿病肾病蛋白尿的发生及进展，其能否作为糖尿病肾病诊断检测的指标还需要进一步的研究。

综上所述，骨化三醇可以调节信号蛋白Smad1水平，从而改善糖尿病肾病大鼠蛋白尿的，改善肾脏功能，延缓糖尿病肾病的发展，给临床上糖尿病肾病的诊断治疗提供了新思路。