HPLC法测定肝宁片中ß，ß´-二甲基丙烯酰阿卡宁的含量

姜启娟，刘炳宏

（1.通化市食品药品检验所，吉林 通化 134001；2.通化市市场监督管理局，吉林 通化 134001）

1 仪器与试药

仪器：高效液相色谱仪（型号：日本岛津L C-2010AHT）、电子天平型号（BT25S 感量：0.1/0.01mg 北京赛多利斯仪器天平有限公司）；ß，ß´-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品（由中国药品生物制品检验所提供）规格：供含量测定用；批号： 111689-200501。水为纯化水，乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：迪马C18（4.6×250mm，5µm）；流动相：乙腈－0.2%甲酸溶液（70：30）；流速： 0.8ml/min；柱温：室温；检测波长：276nm；理论板数按ß，ß´-二甲基丙烯酰阿卡宁峰计算应不低于6000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取ß，ß´-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量，置容量瓶中，加无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，制成每1ml含60µg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取约1g ，置具塞锥形瓶中，加无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液30ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，用无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液洗涤残渣与滤纸，合并滤液，低温蒸干，残渣用无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，转移至10ml量瓶中，加无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备

按处方比例配成不含紫草的样品作为阴性样品，照2.2.2供试品溶液的制备方法，制成阴性样品对照溶液。

3 方法学验证与结果

3.1 线性关系的考察

精密称取ß，ß´-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品适量加无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液制成每1ml含52.2µg的溶液，分别精密吸取2、6、10、14、18µl测定，以对照品量为横坐标，以峰面积为纵坐标，结果ß，ß´-二甲基丙烯酰阿卡宁在0.1044～0.9396µg范围呈良好的线性关系，计算回归方程见表1。

表1 标准曲线数据

3.2 仪器精密度试验

取同一供试品溶液，按拟定的色谱条件进样，连续测定6次。结果色谱峰面积RSD值为0.21%，表明所用仪器精密度良好。

3.3 重复性试验

取同一供试品6份，按所拟定方法独立测定6次，结果ß，ß´-二甲基丙烯酰阿卡宁的平均含量为0.04%， RSD值为1.02%。

3.4 溶液的稳定性考察

取同一供试品溶液，分别在0，3，6，9，18小时，照上述方法测定，按峰面积计算RSD值为1.6%。

3.5 准确度试验

取已知含量的供试品（含量为 0.17mg/片）6份，精密称定，分别精密加入对照品溶液（0.0352mg/ml）10ml，按拟定方法测定，计算回收率，测得ß，ß´-二甲基丙烯酰阿卡宁的平均回收率为96.29%， RSD=0.5% ，结果表明本法回收率较好，准确度较高。见表2。

表2 回收率测定结果（n=6）

4 小 结

4.1 柱的选择及柱效的考察

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈－0.2%甲酸溶液（70：30）为流动相；检测波长为276nm ；柱温：室温。分别采用迪马C18（4.6×250mm，5µm）；大连依利特C18（4.6×250mm，5µm）；大连日普利 C18（4.6×250mm，5µm）的柱测定，结果迪马柱理论板数16642；依利特柱理论板数16925；大连日普利柱理论板数17263。

根据上述三种柱的检测结果，同时参照《中国药典》2015年版一部紫草项下含量测定方法，确定本品理论板数按ß，ß´-二甲基丙烯酰阿卡宁峰计算应不低于6000。

4.2 供试品制备方法的考察

流动相的选择：参照《中国药典》2015年版一部[1]紫草项下含量测定方法，对甲酸的浓度稍作调整，采用乙腈－0.2%甲酸溶液（70：30）为流动相，结果分离效果较好，保留时间适度，因此，确定其为本法的流动相

4.3 供试品制备方法的考察

4.3.1 提取溶剂的考察：

取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取1g ，共取3份，置具塞锥形瓶中，分别加入乙醇，石油醚（60～90℃），无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液各30ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，分别用乙醇，石油醚（60～90℃），无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液洗涤残渣与滤纸，合并滤液，低温蒸干，残渣分别用乙醇，石油醚（60～90℃），无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，分别转移至10ml量瓶中，分别加乙醇，石油醚（60～90℃），无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液稀释至刻度，摇匀，即得。 按拟定方法测定，结果以乙醇，石油醚（60～90℃）提取含量为0.137mg/片、0.141 mg/片、无水乙醇－三氯甲烷（3：2）提取含量为0.168 mg/片，故选择无水乙醇－三氯甲烷（3：2）为本实验提取溶剂。溶剂色谱无干扰。

4.3.2 提取时间的考察：

取本品10片，除去包衣，精密称定，研细，精密称取1g ，共取3份，置具塞锥形瓶中，加入无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液30ml，分别超声处理15分钟，30分钟，60分钟，放冷，滤过，分别用无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液洗涤残渣与滤纸，合并滤液，低温蒸干，残渣分别用无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液溶解，分别转移至10ml量瓶中，分别加无水乙醇－三氯甲烷（3：2）混合溶液稀释至刻度，摇匀，即得。 依正文方法测定，结果超声处理15分钟比30分钟，60分钟低，超声处理30分钟、60分钟结果相近，故选择超声处理30分钟为本实验提取时间。