SPE-GC-MS/MS法测定茶叶中的76种农药残留

陈昌梅，林明霞，兰元

福建省茶叶质量检测与技术推广中心 黄财标技能大师工作室，福建 福州350001

福建是我国茶叶种植、生产和进出口贸易大省，茶叶品类多，六大茶类中的乌龙茶、红茶、白茶、绿茶以及再加工茶类茉莉花茶均在福建茶区较大规模种植和生产。福建茶区的茶叶品质优良，饮茶文化盛行，人们对茶叶卫生质量和安全也格外关注，其中关注度最高的是农药残留[1]。2019年8月15日，国家市场监督管理总局、国家卫生健康委员会和农业农村部联合发布了《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）[2]，其中涉及茶叶的限量有65项，标准中对除特丁硫磷、丁醚脲、草铵膦和氯噻啉等4项农药组分外的61项推荐了26个检测方法标准，这些检测方法标准大多为农药多残留检测方法。

近年来，越来越多的学者针对茶叶中农药多残留的检测技术进行探索研究[3-4]，气相色谱-三重四级杆串联质谱法（GC-MS/MS）因具有选择性高、灵敏度高、定性准确性高和抗干扰能力强等优势越来越受青睐[5-7]。因茶叶中含有数百种化学成分、基质相对复杂，对茶叶中的农药残留进行检测时，容易受到基质干扰。因此，前处理方法的选择尤为重要。QuEChERS 前处理技术具有简便快速的优点，但鉴于茶叶基质的复杂性，固相萃取法（SPE）对茶叶样品的净化更为完全，回收率也高。本文以福建省内生产的绿茶、白茶、乌龙茶及红茶等四大茶类（再加工茶类茉莉花茶的茶坯为绿茶）为研究对象，提供了一种基于SPE技术的可靠、简便的GC-MS/MS 检测方法，对GB 2763—2019标准中规定的使用气相色谱仪、气相质谱仪及气相色谱-三重四级杆串联质谱仪检测的39种农残项目，以及其他农业农村部规定的茶园禁用的农药项目同时进行定性筛查和准确定量检测。

一、材料与方法

1.试验材料

（1）试剂

乙腈（色谱纯，购自美国Merck公司）；甲苯（色谱纯，购自上海安谱有限公司）；丙酮（色谱纯，购自美国TEDIA 公司）；氯化钠（优级纯，购自天津科密欧化学试剂厂）；无水硫酸镁（优级纯，购自国药集团化学试剂有限公司）；实验用水为超纯水机制得的一级水。

（2）材料

固相萃取柱：石墨化炭黑-氨基复合柱（购自岛津上海实验器材有限公司，货号5010-81804），微孔滤膜（有机相，尼龙）：13 mm × 0.22 μm，2 mL的一次性针筒。

（3）标准品

环氧七氯B 内标和其他农药及代谢物标准品均购自农业农村部环境保护科研监测所和北京坛墨质检科技有限公司。

2.仪器设备

三重四级杆气相色谱仪-串联质谱联用仪TQ-8050 （日本岛津公司），配有电子轰击源（EI）；高速粉碎仪（A11，德国IKA）；涡旋振荡仪（VORTEX 3， 德 国IKA）； 旋 转 蒸 发 仪（RV 10，德国IKA）；低速离心机（SC-3610，安徽中科中佳科学仪器有限公司）；全自动氮吹仪（美国Turbo Vap Ⅱ）；电子天平（BS-224S，德国Sartorius）。

3.试验方法

（1）溶液配制

乙腈-甲苯溶液：量取100 mL 甲苯和300 mL乙腈置于500 mL储液瓶中，混匀。

内标溶液：将购置的100 mg/L 内标储备液用丙酮稀释至5 mg/L作为内标溶液，冷藏备用。

混合农药标准中间液：将购置的100 mg/L各农药及代谢物储备液移入2 mL 棕色瓶中避光0～4 ℃保存，配制中间液时吸取六六六、滴滴涕和联苯菊酯各50 μL，其余组分各100 μL 置于10 mL 的棕色容量瓶中，用丙酮定容至刻度，混合均匀后移入20 mL 棕色储液瓶中，避光0～4 ℃保存。

基质混合标准工作液：将1 mL空白基质溶液置于40 ℃水浴旋转蒸发至近干，加入20 μL 内标溶液，再加入1 mL上述中间液稀释成相应浓度的混合农药标准工作液复溶，过微孔滤膜，装入加有0.5 mL内插管的棕色样品瓶，现配现用。

基质标准工作曲线溶液的配制：用基质混合标准工作液配制一系列基质标准工作曲线溶液2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L，并加入20 μL 内标溶液，其中六六六、滴滴涕和联苯菊酯组分在仪器上具有较高的响应，配制成相应较低的浓度系列0.5 μg/L、1.25 μg/L、2.5μg/L、5 μg/L、12.5 μg/L、25 μg/L、50 μg/L、125 μg/L。

经GC-MS/MS 测定，以农药定量离子峰面积与内标定量离子峰面积的比值为纵坐标（Y）、农药标准溶液浓度与内标浓度的比值为横坐标（X）线性拟合，得到各农药组分的基质标准工作曲线。

（2）试样制备

用四分法分取茶样250 g，用高速粉碎仪粉碎，直至全部过425 目的筛网，混匀后于密封袋中保存待测。

（3）样品前处理

提取：称取上述茶样粉末2.00 g（精确至0.01 g）于50 mL 塑料离心管中，加4 mL 水涡旋混匀，于4 ℃冷藏冰箱静置30 min。加入8 mL 乙腈，用涡旋振荡仪涡旋提取5 min，加入2.0～2.5 g氯化钠剧烈涡旋1 min，冰浴超声振荡5 min 后5 000 r/min离心5 min，上清液即提取液，待净化。

净化：在固相萃取柱中加入约1 cm 高的无水硫酸镁，用5 mL乙腈-甲苯预洗固相萃取柱，弃去流出液，待液面接近填料，关闭控制阀，接入100 mL茄形瓶，准确移取茶样提取液2 mL于固相萃取柱中，在柱上安装25 mL 储液器，待液面接近填料，加入10 mL 乙腈-甲苯溶液淋洗小柱，收集所有流出液于40 ℃水浴旋转浓缩至近干，加入20 μL内标溶液，1.0 mL 丙酮涡旋振荡复溶，过微孔滤膜，上机检测。

（4）测定参数

气相色谱条件：色谱柱Agilent DB-5ms（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；载气为氦气（≥99.999%），流速1.65 mL/min；进样口温度250 ℃，进样量1.0 μL，不分流进样；柱温50 ℃保持1 min，以25 ℃/min 的速率升至125 ℃，再以10 ℃/min的速率升至300 ℃，保持13.5 min。

质谱条件：离子源温度200 ℃，接口温度280 ℃，溶剂延迟时间3 min，检测器电压为相对于调谐结果+0.5 kV。多反应监测（MRM）模式：每种农药分别选择1 对定量离子、1 ～2 对定性离子。

特征离子的选择：在气相色谱条件下，质谱采用Q3 Scan 模式在45～500 m/z 范围内对农药标准溶液进行全扫描，对照美国技术与标准研究院（NIST）谱库识别各农药组分，在此基础上进行产物离子扫描，并优化碰撞电压，将优化结果注册到岛津SmartDatebase 数据库中，选择响应较高的离子依次作为定量和定性离子，由此建立MRM检测方法。

每种农药的保留时间、定量定性离子对和碰撞电压见表1。

（5）基质效应试验

购买市售有机红茶、有机乌龙茶、有机绿茶和有机白茶样品，分别按照样品前处理过程进行处理后上机检测，在仪器参考条件下，4种茶样在农药组分出峰处均未检出，故选择这4 种茶叶混合样品作为茶叶空白基质。

由于茶叶中复杂成分可能会对仪器的进样口、检测器等产生干扰，从而影响方法的检出限和灵敏度[8]，因此，为考察茶叶基质对测定结果的影响，分别以丙酮和上述茶叶空白基质溶液按5%、10%、30%、50%、100%的比例稀释为10 μg/L、50 μg/L、200 μg/L 系列农药标准溶液，上机测定。

表1 农药的保留时间、定量定性离子对和碰撞电压

续表1

二、结果与分析

1.基质效应

基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，复杂的茶样基质对不同的农药组分表现出不同程度的增强或抑制效应，部分农药组分如乐果、西玛津、莠去津在基质比例为30%时峰面积就达到峰值并随着基质比例的增加保持稳定，部分农药组分如五氯硝基苯、噻螨酮、对硫磷随着基质比例的增加峰面积不断增加，直至全基质（100%比例）时达到峰值。

按照公式基质效应（%） =（A2-A1）/ A1×100[8]计算基质效应，其中A1为丙酮溶液中农药的峰响应，A2为茶叶空白基质溶液中农药的峰响应，得到农药组分受基质影响的总体情况见图1。从图1可见，使用纯溶剂配制的标准曲线不能准确地对样品中农药组分进行定量，因此，本研究选择茶叶空白全基质配制的基质标准工作曲线进行定量分析。

图1 农药组分受基质影响情况分布图

2. 线性关系和检出限、定量限

各农药组分在相应线性范围内均具有良好的线性关系，相关系数为0.994 4～0.999 9（表2），满足分析测定要求。以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10） 分别作为方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果（表2）表明本方法具有较高的检测灵敏度。

表2 各农药组分线性相关系数、检出限（S/N=3）与定量限（S/N=10）

续表2

3.回收率与精密度实验

为考察检测方法的准确度与精密度，对茶叶空白基质分别进行0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、0.50 mg/kg 3个水平的加标实验，加标回收率与相对标准偏差（RSD）见表3。结果显示，除甲胺磷、乙酰甲胺磷外，茶叶样品3 个水平的农药加标 回 收 率 分 别 为82.7% ～119.5% 、 78.6% ～114.2%、80.4%～109.3%，并且精密度满足检测方法的要求。茶叶空白基质、基质标准溶液和样品加标回收色谱图如图2。

表3 加标回收率与相对标准偏差（n=6）

续表3

续表3

图2 总离子色谱图

4.实际茶叶样品的检测

应用本文所建立的方法对100 份茶叶样品（7份绿茶、56份白茶、15份乌龙茶、22份红茶）进行检测，结果显示，所有检出农药组分的浓度范围均未超出《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2019）所规定的限量值，供试茶叶样品中其他农药组分均未检出，合格率为100%（表4）。

表4 实际样品农残检出情况一览表

三、小结与讨论

本研究建立了茶叶样品中76 种农药组分的检测方法，该方法采用固相萃取净化技术，不需进行耗时耗试剂的均质提取，仅需1 次蒸发浓缩，灵敏度高，准确度与精密度好，能够满足茶叶基质中多种农药组分的痕量检测，可作为GB 2763—2019 中针对茶叶提出的部分使用气相色谱或气质联用方法的检测项目和其他农业农村部规定的茶园禁用农药提供一种准确可靠、简便快捷的检测方法，具有实际的参考应用价值。对于甲胺磷、乙酰甲胺磷等极性较强的有机磷类农药，采用本方法选择的色谱柱检测会受基质干扰而影响分离，导致二者的加标回收率偏低，对此可在今后的研究中进一步改进。