高浓度糖蜜发酵酒精生物抑菌技术的研究

尚红岩，郭艺山，张远平，徐日益，李 静，高亚飞，邓毛程*

(1广东省科学院生物工程研究所，广东广州510316；2广东省绿色制糖工程技术研究中心，广东广州510316；3广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院，广东广州510300)

0 引言

糖蜜是制糖厂的副产物，目前主要用途是发酵生产酒精或酵母。糖蜜除了含有蔗糖、还原糖、氨基酸等可发酵性糖和营养成分外，还含有无机盐、灰分、胶体和微生物等物质，它们会抑制酵母繁殖和发酵。糖蜜发酵酒精相对粗放，原料和水不可避免携带杂菌等微生物，酒精生产主要通过添加硫酸和杀菌剂，来抑制杂菌生长繁殖[1]。近年来，由于糖蜜纯度不断下降，发酵生产酒精过程中染菌更加频繁，硫酸和杀菌剂的用量有不断升高的趋势。大量使用浓硫酸，不仅对环境造成很大的危害，而且容易腐蚀设备和产生积垢，还会增加酒精废液处理的难度和环保资金的投入。硫酸抑制杂菌的同时也会抑制酵母发酵，影响原料出酒率[2-3]。大量使用以抗生素为主的杀菌剂，会使细菌产生抗药性，失去杀菌作用，严重影响酒精发酵效果[4]。

高浓度糖蜜发酵酒精要提高发酵含酒份，并从根本上抑制杂菌，必须在酒精发酵中让酵母形成生长优势，从生存竞争上抑制杂菌，即采取生物抑菌的方法。本研究尝试一方面对糖蜜原料快速澄清并灭菌，尽可能排除糖蜜中抑制酵母繁殖和发酵的胶体和灰分等物质[5-6]；另一方面用高密度培养酵母发酵糖蜜酒精，以高密度酵母细胞较快的发酵速度及竞争性对杂菌形成生长优势，以有效避免杂菌感染，取代硫酸和抗生素抑制杂菌。

1 材料与方法

1.1 实验材料

甘蔗糖蜜：广东翁源县茂源糖业有限公司。

酵母菌种：高活性糖蜜酒精干酵母 SIRI 08-11(广东省科学院生物工程研究所)。

尿素、浓硫酸、青霉素、过磷酸钙、硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、中性醋酸铅溶液、磷酸盐草酸盐混合溶液(脱铅剂)、裴林氏甲乙溶液、1%次甲基蓝指示溶液、0.1%酚酞指示液、10%稀硫酸。

1.2 仪器设备

三角瓶500 mL、三角瓶250 mL、容量瓶250 mL、量筒250 mL、蒸馏烧瓶250 mL、冷凝蛇管、电炉2500 W、温度计1～100℃、糖锤度计、恒温培养箱、水浴锅、显微镜、血球计数板、酒度计(0～12)，上海精密仪器厂；电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；TDL-5A离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 糖蜜澄清处理实验

原糖蜜按以下方案处理：

1.3.1.1 热酸澄清(A处理)

糖蜜稀释到55°Bx，加硫酸调整pH到3.5，并加热到70℃，搅拌自然沉降1 h，离心分离排除沉降物。

1.3.1.2 无酸澄清(B处理)

糖蜜稀释到55°Bx，加热到70℃，加过磷酸钙0.2%(w)，硫酸铵0.5%，自然pH值，搅拌自然沉降1 h，离心分离排除沉降物。

1.3.1.3 常温酸化(C处理)

糖蜜用自来水稀释到 55°Bx，加硫酸调整 pH到3.5，搅拌自然沉降1 h，离心分离排除沉降物。

1.3.1.4 空白实验(D处理)

糖蜜用自来水稀释到55°Bx，搅拌自然沉降1h，自然pH值，离心分离排除沉降物。

取经以上方案处理过的糖蜜100 g，添加0.2%的尿素，分别稀释到25°Bx置于250 mL的三角瓶中，接种1%干酵母，30℃条件下振荡恒温发酵48 h。发酵结束后，测定发酵醪液锤度、残糖份、酒精浓度(V%)和挥发酸。

1.3.2 不同酵母密度发酵酒精实验

酵母培养液：用无酸澄清B处理糖蜜，用自来水稀释至糖蜜浓度15°Bx，添加0.3%的尿素。

发酵培养液：原糖蜜稀释至糖蜜浓度45°Bx。

实验步骤：取酵母培养液150 mL于500 mL三角瓶中，分别接种0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%的活性干酵母，并分别培养至酵母密度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5亿/mL，分别标记为 F1、F2、F3、F4和 F5，然后分别缓慢加入1:1的发酵培养液150 mL，恒温31℃发酵48 h，化验分析发酵醪液锤度、残糖份、酒精浓度和挥发酸。

1.4 分析方法

酒精浓度(V%)：用平底烧瓶蒸馏发酵醪液，并安装冷凝管收集镏出液，用酒度计(上海精密仪器厂)测定镏出液酒精浓度[7]。

用血球计数板测定酵母培养液中的酵母菌数量。

用兰因-艾农(Lane-Eynon)恒容法[7]测定发酵液残糖份(残还原物)。

用碱液滴定法测定发酵蒸馏酒液的挥发酸[7]。

2 结果与讨论

2.1 高浓度糖蜜澄清发酵实验结果

高浓度糖蜜(55°Bx)经过热酸快速澄清、无酸澄清、常温酸化和单纯稀释(空白实验)等处理后，分别稀释到25°Bx接种干酵母发酵(分别标记为A热酸、B无酸、C酸化、D空白)，实验结果如表1，发酵后锤度、酒份、残糖份和挥发酸等数据对比见图 1～图 4。

表1 25 °Bx糖蜜澄清发酵实验结果

从表1和图1、图2、图3可以看出高浓度糖蜜4种处理方案发酵后的锤度依次增加，即发酵不完全程度依次升高，发酵含酒份依次降低，残糖份依次升高。综合发酵后锤度、含酒份和残糖份等指标，糖蜜4种处理方案中热酸处理方案发酵效果相对最好，发酵后锤度最低，发酵酒份最高，残糖份最低，发酵最彻底；其次是无酸处理方案，发酵后锤度、酒份与残糖份等指标和热酸处理方案差别不大，此方案的优势是无需添加硫酸；接着是常温酸化处理，发酵后锤度较高，酒份较低，残糖份较高；处理效果最差的是单纯稀释（空白实验）方案，发酵后锤度高，酒份低，残糖份高，发酵不完全。

图1 4种糖蜜处理方案发酵后锤度

图2 4种糖蜜处理方案发酵后酒份

图3 4种糖蜜处理方案发酵后残糖份

图4 4种糖蜜处理方案发酵后挥发酸

挥发酸是由产酸细菌产生的，挥发酸越高表明污染细菌越多，在糖蜜酒精生产中挥发酸一般控制在0.02 g/100 mL以内。从表1和图4可以看出，高浓度糖蜜4种处理方案发酵后，热酸处理的挥发酸最低，表明染菌程度最低；无酸处理、酸化处理和单纯稀释的挥发酸依次增高；无酸处理、酸化处理方案的挥发酸也在可控范围之内；单纯稀释的挥发酸最高，已经到染菌较严重的地步，导致糖蜜发酵含酒份低，残糖份高，发酵不彻底。

2.2 不同酵母密度发酵酒精实验结果

接种不同量干酵母并分别培养至不同酵母密度发酵高浓度糖蜜，发酵后发酵液锤度、含酒份、残糖份和挥发酸的分析数据见表2，其变化趋势见图5、图6、图7和图8。

表2 不同酵母密度发酵酒精实验结果

从表2和图5、图6和图7可以看出酵母数在0.5～2.0亿/mL之间，随着酵母培养密度增大，发酵后度降低，发酵含酒份升高，残糖份降低；酵母密度大，发酵更彻底。从表2和图8可以看出随着酵母培养密度增大，发酵酒液挥发酸降低。主要原因是高密度酵母发酵速度快，并且在与细菌的生存竞争中取得生长优势从而抑制细菌，使糖蜜中更多的糖发酵转化成酒精。酵母培养细胞数 2.0亿/mL和2.5亿/mL，发酵后发酵液锤度、发酵含酒份、残糖份和挥发酸变化不大。一般糖蜜酒精生产培养酵母数控制为2.0亿/mL比较合适，既能抑制杂菌，又不会消耗太多糖蜜培养酵母。

图5 不同酵母密度发酵液锤度

图6 不同酵母密度发酵含酒份

图7 不同酵母密度发酵液残糖份

图8 不同酵母密度发酵酒液挥发酸

3 结论与展望

高浓度糖蜜分别用热酸澄清、无酸澄清、常温酸化和单纯稀释(空白实验)等 4种方法处理后，发酵含酒份(V/V%)分别为8.38%、8.32%、8.05%、7.82%；残糖份分别为1.45%、1.52%、1.87%、2.26%；热酸澄清处理糖蜜发酵酒份最高，残糖份等最低，发酵效果相对最好；无酸澄清糖蜜发酵效果也较好。将酵母培养至0.5、1.0、1.5、2.0和2.5亿/mL等5种密度后发酵，含酒份分别为：9.38%、9.72%、10.16%、10.45%、10.46%；残糖份分别为 2.93%、2.38%、1.87%、1.54%、1.54%；挥发酸分别为：0.0264、0.018、0.012、0.0096、0.0096 g/100 mL。酵母培养密度在0.5～2.0亿/mL之间，随着酵母密度增加，发酵含酒份升高，残糖份和挥发酸等降低；酵母培养细胞数到 2.5亿/mL，发酵含酒份、残糖份等指标和酵母密度2.0亿/mL相比变化不大，一般糖蜜酒精生产培养酵母数控制2.0亿/mL较合适。

用高密度培养酵母发酵高浓度糖蜜，可以有效避免细菌感染，发酵酒份高，发酵更彻底，提高酒精原料出酒率，为企业创造较好的经济效益；该技术还可以减少酒精废液中残糖份等有机物残留，并减少用于抑菌的硫酸与抗生素的残留，有利于酒精废液处理和资源化利用，能产生显著的社会效益。