rRNA二级结构在黏孢子虫研究中的应用

谭禄奇

（重庆师范大学 生命科学学院，重庆 401331）

2006年诺贝尔生理或医学奖授予美国斯坦福大学医学院的安德鲁·菲尔（Andrew Fire）和麻省理工大学医学院的克雷格·梅洛（Craig Mello），以表彰他们发现RNA双链能引发基因沉默[1]，这使得学者们关注到RNA在生物信息上的重要作用，并开始研究RNA分子的结构与功能之间的关系。

目前的黏孢子虫研究中，主要是利用核糖体RNA（Ribosomal RNA，rRNA）的一级结构结合形态学对物种进行鉴定和分类，利用rRNA序列进行生物信息比较和推测黏孢子虫物种和类群之间的系统发育关系。rRNA二级结构已被广泛应用于多个领域，但在黏孢子虫的研究中只有部分学者应用。本文将rRNA二级结构及其在黏孢子虫中的应用进行综述，以期为以后的黏孢子虫研究提供参考。

1 rRNA二级结构特征

rRNA二级结构是由其一级结构通过A-U和G-C配对，自身回折形成双链和环状结构以及部分单链组合形成的平面结构。rRNA的二级结构比其一级结构（序列）更加保守，不同的同源rRNA序列可能有相同或相似的二级结构，只要原有的碱基互补情况没有变化，其二级结构就会较为稳定。但也有可能在一级结构中少数的碱基改变导致碱基互补改变，在二级结构中引起本质性的差异。

rRNA的功能往往与其结构有着密切的关系。rRNA二级结构是形成rRNA三级结构的基础，是通过其一级结构了解其三级结构和更高级结构的一个途径，进而了解rRNA结构与功能的关系。通过对RNA结构研究已经证明，RNA二级结构中的许多环状结构与RNA的功能密切相关，而rRNA也不例外。

2 rRNA二级结构的预测

目前，学者们已开发了很多预测RNA二级结构的软件，常用的有RNAfold、MFOLD、Pfold和RNAStructure等。在黏孢子虫的研究中，主要利用的是MFOLD和RNAStructure。MFOLD为在Unix平台操作的软件，由ZUKER开发，主要原理是最小自由能方法和动态规划算法[2]。MFOLD软件不仅可以人为设定先验知识、内环的最大不对称值和碱基对之间的最大距离等参数，还支持环形RNA的预测，且每次提供多个可选择结构以及图形输出，但是只能测定单个序列[3]。RNAstructure为在Windows系统操作的软件，是DAVID根据Sankoff算法和动态规划算法开发的[4]，此软件功能强大、操作简单，每次可以提供一个或数个可供选择的结构，但此软件的字母表只能选择AGCU，无法识别其他字母[3]。

3 rRNA二级结构在黏孢子虫分子系统学中的应用

以往对于黏孢子虫的分子研究，主要应用的是小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）基因，此基因是地球上所有生命中普遍存在的基因，其长度适中、所含信息量大、容易获取且进化速度比较缓慢。利用SSU rRNA的一级结构可以确定同种生物的遗传变异和不同种生物的分子差异，利用SSU rRNA的一级结构构建的分子系统树还可以探讨生物物种在进化过程中的地位、分歧时间以及亲缘关系等系统发育问题。虽然基于SSU rRNA基因一级结构为分子标记的系统学研究解决了很多问题，但一级结构在系统学研究中仍然具有一定的局限性。

已有研究表明，SSU rRNA基因各结构域的二级结构信息可以作为系统发育分析和物种分类的有用标记[5]，SSU rRNA基因的二级结构是解决许多生物群体中某些进化和分类问题的有力工具。因此，黏孢子虫研究者也开始利用SSU rRNA基因的二级结构进行进化和分类问题的研究。

2007年，HOLZER等[6]预 测 了 鳟 球 孢 虫（Sphaerospora truttaeFischer-Scherl et al.，1986）和其他28种黏孢子虫以及鲟卵螅（Polypodium hydriformeUssov，1885）的18S rRNA基因的二级结构，结合系统发育树分析研究了黏体虫纲的系统进化，这是二级结构首次应用于黏孢子虫的研究中。他们发现，18S rRNA的黏体虫V4和V7二级结构具有有价值的、复杂的特征，可以提供重要的额外信息来补充基于这些区域以外的主要序列数据的系统发育研究。他们研究确定了黏体动物18S rRNA的结构进化变化，认为为了在系统发育分析中包含可变区域，必须保证类群之间的位置核苷酸同源性，且无脊椎动物宿主转换似乎与18S rRNA的结构变化和更高的系统发育聚类密切相关。

此后，部分该领域学者也开始构建二级结构，并用于物种的辅助分类和探索物种间的系统发育与结构之间的关系。2010年，HOLZER等[7]预测了海式楚克拉虫（Zschokkella hildaeAuerbach，1910）及其近源种和其他黏孢子虫的SSU-rDNA的二级结构，发现寄生于泌尿系统的所有海洋分支黏体虫在V4区存在一个共同的结构，这种结构在同样寄生于泌尿系统的球孢虫中也存在，这种结构在这两个群之间建立了一种联系。2018年，杨生华等[8]预测了口腔碘泡虫（Myxobolus oralisLiu et al.，2014）、倪李碘泡虫（Myxobolus nieliiLandsberg & Lom，1991）、住心碘泡虫（Myxobolus heartiChen，1998）、多涅茨尾孢虫（Henneguya doneciSchulman，1962）这几个近源种的18S rRNA V4区二级结构，并进行了比较区分。2020年，张金叶等[9]预测了田中碘泡虫（Myxobolus tanakaiKato et al.，2017）及其近源种的二级结构，选取V2、V4和V7区分析了它们的变异度。2020年，CHEN等[10]对应系统发育树构建了62种黏孢子虫SSU-rRNA序列的二级结构，发现H37、H17、E23_15和H24的结构差异与系统发育聚类密切相关。2021年，XIANG等[11]预测了伪显著碘泡虫（Myxobolus pseudonobilisXiang et al.，2021）及其近源种的18S rRNA二级结构，并结合其他特征确定了伪显著碘泡虫为独立物种。

4 结论与展望

目前关于黏孢子虫的研究，二级结构分析还不普遍。科研者对于rRNA一级结构折叠为二级结构的很多机制还不是很了解，因此现在开发的二级结构预测软件预测的二级结构是否是真实的还未可知，rRNA序列折叠为更高级结构的机制有待进一步研究。但是，rRNA作为良好的分子材料，利用其二级结构进行系统学研究对于分类学和系统发育学的发展都有着很重要的意义。