miR-381靶向TMEM16A对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

柯 超，蒋 斌，周红见，李全富

胃癌在全球范围内均有较高的致死率，胃癌细胞的无限增殖和局部、远处转移是预后不佳的主要原因[1]，然而，胃癌增殖侵袭机制的研究尚无突破性进展。大量证据[2-3]表明，miRNA在多种癌症中存在表达异常，可能参与细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等过程。因此，识别肿瘤特异性miRNA，将有利于肿瘤的诊断、治疗及预后。据报道[4]，miR-381在胃癌中低表达，可调控LRH-1、Twist1表达抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。调控跨膜蛋白16A(transmembrane protein 16A，TMEM16A)属于钙离子激活的氯离子通道蛋白，参与细胞信号转导、平滑肌收缩等[5]。研究[6]发现，miR-381可靶向TMEM16A抑制胃癌细胞上皮间质转化。该研究旨在明确miR-381和TMEM16A的靶向关系，观察miR-381是否通过TMEM16A影响胃癌细胞AGS生物学行为，为胃癌的治疗提供有效分子靶点。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1组织 选取2018年3月—2019年3月行手术切除的胃癌患者34例，采集其癌组织及癌旁正常组织(距癌低于3 cm)，组织样本保存于液氮罐中；患者经术后病理检测确诊为胃癌，知情且同意本次采集，本研究经武汉市第三医院伦理委员会批准。

1.1.2细胞株 胃癌细胞AGS、MKN45、SGC7901和正常人胃黏膜细胞GES-1购自上海生物细胞研究所，胃癌细胞的生物学特性见表1。

表1 胃癌细胞AGS、MKN45、SGC790的生物学特性

1.2 主要试剂与仪器胎牛血清、RPMI1640培养基、DMSO(美国Gibco公司)，引物序列由江苏百奥迈科生物技术有限公司合成，脂质体3000试剂盒(美国Invitrogen公司),逆转录试剂盒(美国GeneCopoeia公司),荧光素酶报告系统(美国Promega公司),MTT粉末(上海广锐生物科技有限公司),FITC-Annexin V/PI试剂盒(德国Miltenyi公司),Transwell小室(上海子起生物科技有限公司),蛋白一抗(美国Cell Signaling公司),细胞培养箱(上海轩仪仪器设备有限公司),qRT-PCR仪(美国BioRad公司),流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3 方法

1.3.1细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育；待细胞融合至80%～90%时，消化传代培养；取生长状况良好的细胞用于后续实验。

1.3.2细胞分组与转染 将AGS细胞分为空白对照组、miR-381过表达组(miR-381-mimics)、TMEM16A干扰组(TMEM16A-siRNA)，采用脂质体3000试剂盒，分别将miR-381-NC、miR-381-mimics、TMEM16A-siRNA转染AGS细胞，采用流式细胞仪检测转染效率，筛选转染效率在60%的细胞用于后续实验。

1.3.3qRT-PCR检测组织和细胞中miR-381和TMEM16A mRNA的表达 采用TRIzol法提取组织、细胞中的总RNA，应用逆转录试剂盒合成cDNA，混入荧光染料后进行qRT-PCR，采用2-ΔΔCt法，以U6为内参定量，计算miR-381的表达；以GADPH为内参定量，计算TMEM16A mRNA的表达。各基因引物序列[7-8]见表2，作5次独立重复实验。

表2 基因引物序列

1.3.4双荧光素酶实验 应用生物信息学预测软件TargetScan3.1对miR-381和TMEM16A的靶向关系进行预测；根据预测结果，合成含有结合位点DNA片段的野生型(wild type，wt)以及含有结合位点突变体DNA片段的突变型(mutant，mut)，构建荧光素酶报告载体；采用脂质体3000试剂盒，将TMEM16A 3′-wt、TMEM16A 3′-mut及miR-381-mimics转染AGS细胞，培养48 h后检测各组细胞荧光素酶活性。

1.3.5MTT法检测细胞增殖 将各组细胞接种至96孔板，分别培养24、48、72 h，加入MTT溶液，继续培养4 h，弃液后加入DMSO，轻微震荡6 min，于570 nm处检测各孔吸光度(optical density，OD)值，OD值越大表明细胞密度越大。

1.3.6流式细胞仪检测细胞凋亡 收集各组细胞，重悬于孵育缓冲液，离心后加入FITC-Annexin V和PI染液混匀，室温下避光反应5 min；孵育缓冲液清洗后，加入荧光SA-FLOUS溶液，避光条件下4 ℃孵育 20 min；应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。散点图结果：左下象限(FITC-/PI-)显示活细胞，右上象限FITC+/PI+)为坏死细胞，右下象限(FITC+/PI-)为凋亡细胞。

1.3.7Transwell小室法检测细胞侵袭 将基质胶包裹Transwell小室，凝固后接种各组细胞于上室，并在下室中接入含20%的RPMI1640培养基；培养48 h后，吸弃Transwell小室上室中培养液，并拭去膜内侧多余细胞；取出小室固定于4%多聚甲醛中，反应20 min；滴加DAPI染色，于显微镜下观察、计数侵袭细胞数。

1.3.8Western blot检测细胞中蛋白的表达 收集各组细胞，加入裂解液充分提取细胞中总蛋白，经BCA法检测蛋白浓度，各组取等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转膜，将PVDF膜置于5%脱脂奶粉中封闭2 h，分别加入相应蛋白一抗(1 ∶1 000)于4 ℃过夜，再置于 HRP标记的二抗(1 ∶8 000)中37 ℃反应1 h；最后滴加ECL发光显示蛋白条带，应用Image J软件灰度分析各蛋白条带，以β-actin为内参，计算含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-3、caspase-9)、E钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP-2、MMP-9)的表达量(目标蛋白表达量=目标蛋白灰度值均值/β-actin灰度值均值)。

2 结果

2.1 不同组织和细胞中miR-381和TMEM16A mRNA表达的比较采用TRIzol法提取不同组织和细胞中的总RNA，用qRT-PCR分析miR-381和TMEM16A mRNA的相对表达水平，结果显示，胃癌组织miR-381的相对表达水平为0.37±0.06，癌旁正常组织为0.82±0.12；与癌旁正常组织相比，胃癌组织中miR-381表达降低(t=19.558，P<0.001)。胃癌细胞AGS、MKN45、SGC7901和正常细胞GES-1中miR-381相对表达水平分别为0.29±0.05、0.47±0.09、0.82±0.07和1.00±0.11，差异有统计学意义(F=75.676，P<0.001)；与人正常胃黏膜细胞GES-1相比，胃癌细胞AGS、MKN45、SGC7901中miR-381表达均下降(qAGS=19.113，P<0.001；qMKN45=14.267，P<0.001；qSGC7901=4.845，P=0.004)。

胃癌组织TMEM16A mRNA的相对表达水平为0.98±0.12，癌旁正常组织为0.30±0.07；与癌旁正常组织相比，胃癌组织中TMEM16A mRNA表达升高(t=28.541，P<0.001)。胃癌细胞AGS、MKN45、SGC7901和正常细胞GES-1中TMEM16A mRNA相对表达水平分别为1.65±0.15、1.32±0.10、1.19±0.14和1.00±0.12，差异有统计学意义(F=22.516，P<0.001)；与人正常胃黏膜细胞GES-1相比，胃癌细胞AGS、MKN45、SGC7901中TMEM16A mRNA表达均升高(qAGS=11.272，P<0.001；qMKN45=5.550，P=0.003；qSGC7901=3.295，P=0.033)。

2.2 过表达miR-381对AGS细胞中miR-381和TMEM16A mRNA表达的影响将miR-381-mimics、TMEM16A-siRNA转染AGS细胞，经流式细胞仪测得转染效率分别为62.37%和65.38%，可用于后续实验；采用TRIzol法提取各组细胞中的总RNA，用qRT-PCR分析miR-381和TMEM16A mRNA的相对表达水平，结果如表3所示，与空白对照组相比，miR-381-mimics组细胞中miR-381的表达上升(q=94.524，P<0.001)， TMEM16A mRNA表达下降(q=16.045，P<0.001)；TMEM16A-siRNA组TMEM16A mRNA表达下降(q=26.407，P<0.05)，但miR-381的表达无变化(q=0.247，P=0.864)；联合转染组miR-381的表达上升(q=92.300，P<0.001)，但与miR-381-mimics组比较无差异(q=2.224，P=0.136)，TMEM16A mRNA表达下降(q=29.415，P<0.001)，且明显低于miR-381-mimics组、TMEM16A-siRNA组(qmiR-381-mimics=13.371，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=3.008，P=0.049)，详见表3。miR-381-mimics对TMEM16A mRNA的沉默效率为(46.6±1.8)%，TMEM16A-siRNA对TMEM16A mRNA的沉默效率为(76.3±2.4)%，miR-381-mimics联合TMEM16A-siRNA对TMEM16A mRNA的沉默效率为(85.4±2.1)%。

表3 各组细胞中miR-381和TMEM16A mRNA表达的比较

2.3 miR-381和TMEM16A靶向关系应用TargetScan3.1软件预测miR-381和TMEM16A的靶向关系，可能的结合位点如图1所示；根据预测结果，构建荧光素酶报告载体验证靶向关系。双荧光素酶实验结果显示，TMEM16A 3′-wt对照组细胞中荧光素酶活性为1.00±0.11，而共转染TMEM16A 3′-wt和miR-381-mimics组为0.37±0.07，其荧光素酶活性低于TMEM16A 3′-mut对照组(t=10.804，P<0.001)；TMEM16A 3′-mut对照组细胞中荧光素酶活性为0.98±0.08，共转染TMEM16A 3′-mut和miR-381-mimics组为1.03±0.10，与TMEM16A 3′-mut对照组比较无差异(t=0.329，P=0.751；t=0.451，P=0.664)，证实miR-381和TMEM16A的靶向关系。

图1 miR-381和TMEM16A预测结合位点

2.4 miR-381靶向TMEM16A对AGS细胞增殖的影响采用MTT法检测各组细胞的增殖活性，结果显示，与空白对照组相比，miR-381-mimics组、TMEM16A-siRNA组及联合组细胞增殖明显被抑制，具体OD值见表4；采用Western blot法检测各组细胞中p27的相对表达量，结果如图2所示，空白对照组、miR-381-mimics组、TMEM16A-siRNA组及联合组p27的相对表达量分别为1.00±0.11、1.29±0.13、1.34±0.12及1.56±0.14，差异有统计学意义(F=16.854，P<0.001)；与空白对照组相比，其余各组p27的表达均增加(qmiR-381-mimics=5.167，P=0.002；qTMEM16A-siRNA=6.058，P=0.002；q联合组=9.978，P<0.001)。

表4 各组细胞OD570nm值的比较

图2 miR-381靶向TMEM16A对AGS细胞中p27表达的影响

1：空白对照组；2：miR-381-mimics组；3：TMEM16A-siRNA组；4：联合组

2.5 miR-381靶向TMEM16A对AGS细胞凋亡的影响采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，结果显示，空白对照组、miR-381-mimics组、TMEM16A-siRNA组及联合组细胞凋亡率分别为(3.41±0.82)%、(13.54±2.51)%、(16.78±3.16)%及(22.37±3.58)%，差异有统计学意义(F=42.574，P<0.001)；与空白对照组相比，miR-381-mimics组、TMEM16A-siRNA组及联合组细胞凋亡率明显增加(qmiR-381-mimics=8.302，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=10.958，P<0.001；q联合组=15.539，P<0.001)。采用Western blot法检测各组细胞中caspase-3、caspase-9的相对表达量，结果如图3、表5所示，与空白对照组相比，其余各组细胞中caspase-3、caspase-9的相对表达量明显增加(caspase-3：qmiR-381-mimics=5.912，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=6.651，P<0.001；q联合组=9.791，P<0.001。caspase-9：qmiR-381-mimics=3.367，P=0.030；qTMEM16A-siRNA=5.316，P=0.005；q联合组=8.505，P<0.001)。

图3 miR-381靶向TMEM16A对AGS细胞中caspase-3、caspase-9表达的影响

2.6 miR-381靶向TMEM16A对AGS细胞侵袭的影响采用Transwell小室法检测各组细胞侵袭能力，结果显示，空白对照组、miR-381-mimics组、TMEM16A-siRNA组及联合组侵袭细胞数分别为(186.25±22.47)个、(83.46±16.72)个、(41.96±14.08)个及(25.34±6.57)个，差异有统计学意义(F=101.790，P<0.001)；与空白对照组相比，miR-381-mimics组、TMEM16A-siRNA组及联合组侵袭细胞数明显下降(qmiR-381-mimics=14.352，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=20.147，P<0.001；q联合组=22.467，P<0.001)。采用Western blot法检测各组细胞中E-cadherin、Vimentin、MMP-2及MMP-9的相对表达量，结果如图4、表6所示，与空白对照组相比，其余各组细胞中Vimentin、MMP-2及MMP-9的表达明显下降(Vimentin：miR-381-mimics=4.002，P=0.012；qTMEM16A-siRNA=8.804，P<0.001；q联合组=17.875，P<0.001;MMP-2：miR-381-mimics=6.521，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=12.259，P<0.001；q联合组=20.605，P<0.001;MMP-9：miR-381-mimics=9.141，P<0.001；qTMEM16A-siRNA=10.911，P<0.001；q联合组=18.578，P<0.001)，E-cadherin的表达明显增加(miR-381-mimics=5.240，P=0.002；qTMEM16A-siRNA=7.569，P<0.001；q联合组=8.927，P<0.001)。

表5 各组细胞中caspase-3、caspase-9相对表达量的比较

图4 miR-381靶向TMEM16A对AGS细胞中E-cadherin、Vimentin、MMP-2及MMP-9表达的影响

表6 各组细胞中E-cadherin、Vimentin、MMP-2及MMP-9相对表达量的比较

3 讨论

miR-381定位于染色体14q32.31位点，该位点还包含有多种肿瘤抑制靶点miR-154、miR-377等。Tang et al[9]研究指出，miR-381在胶质瘤中表达增加，可促进肿瘤的恶性进展。而Xia et al[10]研究发现，miR-381可通过下调YY1抑制上皮性卵巢癌。上述研究表明，miR-381在不同的肿瘤类型中发挥着抗癌或促癌作用，因此，针对miR-381的肿瘤治疗必须考虑其双重调控功能。本研究结果显示，miR-381在胃癌组织和细胞系中呈低表达，与王丽 等[11]研究结果一致。miRNA的调控机制是非常复杂的，可参与DNA拷贝数变化、DNA甲基化、组蛋白修饰等过程，而且调控可发生于多个水平，如转录前、转录时及转录后。

TMEM16A是一种潜在的致癌基因，可调节胞内氯离子浓度激活MAPK信号通路，促进肿瘤的发生发展。Liu et al[12]研究发现，过表达TMEM16A可能通过TGF-β信号通路促进胃癌细胞的增殖和侵袭，提示TMEM16A与胃癌细胞的生物学行为密切相关。本研究通过在线生物信息学预测软件和双荧光素酶实验证实miR-381和TMEM16A的靶向关系，同时过表达miR-381的AGS细胞中TMEM16A mRNA表达下降，进一步验证miR-381可负向调控TMEM16A的表达。

本研究显示， miR-381可靶向TMEM16A抑制胃癌细胞AGS的增殖和侵袭，并促进其凋亡。P27蛋白是细胞周期素依赖激酶抑制剂，可抑制细胞由G1期进入S期[13]，因此，P27低表达可以加速细胞周期的进程，促进细胞增殖。本研究结果显示，miR-381可靶向TMEM16A促进P27的表达，提示miR-381可靶向TMEM16A抑制胃癌细胞AGS的增殖，可能与上调P27的表达有关。Caspase家族与真核细胞凋亡密切相关，Caspase-9是凋亡的触发剂，而Caspase-3是凋亡的直接执行者[14]。本研究显示，miR-381可靶向TMEM16A促进Caspase-3、Caspase-9的表达，揭示miR-381可靶向TMEM16A促进胃癌细胞AGS的凋亡，可能与上调Caspase-3、Caspase-9的表达有关。上皮间质转化是肿瘤细胞发生侵袭和迁移过程的重要生物学机制，E-cadherin是肿瘤浸润抑制基因，可增强细胞简单黏附作用，维持细胞骨架的稳定，阻碍肿瘤细胞的侵袭；Vimentin是间质细胞中的纤维蛋白，可用于评估上皮性肿瘤有无转移；MMP家族可有效分解基底膜和细胞外基质的主要成分，促进肿瘤细胞对邻近组织的侵袭[15]。本研究显示，miR-381可靶向TMEM16A促进E-cadherin的表达，抑制Vimentin、MMP-2及MMP-9 的表达，提示miR-381可靶向TMEM16A抑制胃癌细胞AGS的侵袭，可能与调控上皮间质转化相关基因E-cadherin、Vimentin、MMP-2及MMP-9的表达有关。

总之，本研究显示miR-381在胃癌中低表达，并靶向TMEM16A抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，促进其凋亡，可能与调控P27、Caspase-3、Caspase-9、E-cadherin、Vimentin、MMP-2及MMP-9的表达有关。后续将选用动物模型，深入探究miR-381靶向TMEM16A对胃癌的影响。