液相色谱-串联质谱法测定洋葱、葱、姜、蒜及韭菜中28种有机磷农药残留量

王孝钢 范津珲 江志训 刘彩飞

摘    要：為解决有机磷农药残留量检测分析过程中基质效应影响检测结果的问题，本研究以电喷雾（ESI）为离子源，正离子模式多级反应离子检测（MRM）方式，建立了一种灵敏度高、选择性强的基质校正液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS），以同时测定洋葱、葱、姜、蒜及韭菜中28种有机磷农药残留量。以洋葱为试材，优化选择了乙酸/乙腈（1：100Vol）+6 g氯化钠为最佳提取体系，并确定超声提取30 min、快速混匀器振荡1.5 min为最佳提取条件。利用该方法检测洋葱28种有机磷农药含量，在0.200～100 μg·L-1质量浓度范围内其与峰面积之间呈线性关系，相关系数为0.998 27～0.999 90;方法检出限0.06～0.89 μg·kg-1，定量限0.24～3.6 μg·kg-1;28种有机磷农药残留量在10.0，50.0，200 μg·kg-13个浓度水平的平均回收率为76.4%～102.6%，相对标准偏差为1.1%～9.0%。利用该方法检测葱、姜、蒜及韭菜中28种有机磷农药残留量在10 μg·kg-1浓度水平的平均回收率为74.7%～109.9%，相对标准偏差为0.61%～6.2%。综合而言，所建立的新方法能满足实际样品分析检测的要求。

关键词：液相色谱-串联质谱法;有机磷农药;洋葱;葱;姜;蒜;韭菜

中图分类号：0657.63;S481.8         文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.12.012

Determination of 28 Organophosphorus Pesticide Residues in Onion， Scallion， Ginger， Garlic and Leek by LC/MS/MS

WANG Xiaogang1， FAN Jinhui1， Jiang Zhixun1， LIU Caifei2

（1. Qingdao Academy of Agricultural Sciences， Qingdao， Shandong 266109， China; 2. Agricultural and Rural Bureau of Jimo District， Qingdao， Shandong 266200， China）

Abstract： In order to solve the matrix effect in the detection process， the experiment developed a highly sensitive， selective， and matrix corrected LC-MS/MS method by electrospray ionization （ESI） as ion source and MRM in positive ion mode， which could simultaneously determine 28 organophosphorus pesticide residues of onion， scallion， ginger， garlic and leek. Using onion as material， the conditions of HPLC and MS for determination of 28 organophosphorus pesticides were optimized， the optimal extraction system were acetic acid /acetonitrile （1：100Vol） +6 g NaCl， and the optimal extraction process were 30 min of ultrasonic extraction and 1.5 min rapid mixer oscillation. The above method were used to detect  the 28 organophosphorus pesticides in onion， there was a good linear relationship between the organophosphorus pesticides content and peak area in the range of 0.200-100 μg·L-1， and the correlation coefficients were 0.998 27-0.999 90; the detection and quantitation limit were in the range of 0.06-0.89 μg·kg-1 and 0.24-3.6 g·kg-1， respectively; the recovery rate of 28 organophosphorus pesticides residues for 10， 50， 200 μg·kg-1 levels ranged from 76.4% to 102.6%， which the relative standard deviation were ranged from1.1% to 9.0%. The above method were used to detect the 28 organophosphorus pesticides residues in scallion， ginger， garlic， and leek， the recovery rate for 10 μg·kg-1 level were ranged from 74.7% to 109.9% ， which the relative standard deviation were ranged from 0.61% to 6.2%. Comprehensively， the new method could meet the requirements of actual sample analysis.

Key words： LC-MS/MS; organophosphorus pesticide residues; onion; scallion; ginger; garlic; leek

有机磷农药是一类广泛用于防治植物病虫害的高效广谱杀虫剂，同时对人畜也有较高的毒害性。在日常农产品检测中，常常在蔬菜、水果中能检测出有机磷农药残留。洋葱、葱、姜、蒜及韭菜等是一类具特殊香辛的鳞茎类蔬菜，该类蔬菜基质中含有大量的含硫化合物，对准确测定有机磷农药残留量的影响很大，易出现假阳性和假阴性，是农药残留检测公认的测定难题[1]。因此，研究洋葱、葱、姜、蒜及韭菜中多种有机磷残留检测技术具有十分重要的意义。

测定鳞茎类蔬菜中有机磷农药的分析方法主要有气相色谱法[2-4]、气相色谱-质谱联用法[1-2，5]、液相色谱-串联质谱法[7-8]和超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法[9]。由于有机磷农药种类很多，不同有机磷农药的性质差别很大，一些有机磷农药如氧乐果、磷胺和辛硫磷等由于极性和热不稳定性问题，用气相色谱法和气相色谱质谱法无法测定或者灵敏度很低。液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法通过采用多级反应离子检测（MRM），不但测定的灵敏度高，抗干扰能力强，而且能够同时定性和定量，是测定有机磷农药较理想的方法。但用HPLC-MS/MS分析复杂基体时，样品中共流出物质产生基质效应能够抑制或增强待测物质的响应值，从而影响待测物质浓度的测定。苏建峰等[6]用乙腈涡旋提取，提取液经Carb、C18和PSA 粉末分散固相萃取净化，超高效液相色谱-串联质谱法快速测定葱、姜、蒜与辣椒酱中66种有机磷农药残留，方法的回收率在52%～117%之间，其中5%的农药回收率在50～70%之间。有关同时测定洋葱、葱、姜、蒜及韭菜中28种有机磷农药残留量的研究较少，前期试验也验证了用气相色谱-火焰光度检测器测定，基质干扰很大[1，6]，特别是大蒜基质，即使选择性好的火焰光度检测器，色谱出峰前20 min 以内仍出现很强的平头峰，难以准确定量。为解决基质效应问题，本研究详细探讨了影响测定有机磷农药提取效率的主要因素，并采用基质校正外标法定量，建立了同时测定洋葱、葱、姜、蒜及韭菜中28种有机磷农药残留量的液相色谱串联质谱分析方法。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

仪器：Agilent Technologies 6460  Triple Quad LC/MS 液相色谱/三重四极串联质谱联用仪（安捷伦公司）， 配有1200 Series G1312 B 二元泵，G1322A 脱气机、G13670D 自动进样器、G1316B柱温箱。仪器操作系统为Mass Hunter软件。碰撞气为氮气（纯度99.999% ）。B 5500S-MTH超声波清洗器（必能信超声（上海）有限公司）。TDL-5-A台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。SZ-1型快速混匀器（江苏金坛市金城国盛实验仪器厂）。ZORBAX Eclipse  XDB C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm ）液相色谱柱 。

试剂：甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher 公司）。甲酸99%（色谱纯，ROE Scientific INC.）;乙酸99.5%（天津博迪化工股份有限公司）;氯化钠（分析纯）：140 ℃烘4 h。屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。Nylon with Polypropylene Prefilters针式过滤头滤膜0.22 μm，13 mm（Agela Technologies）。

1.2 标准样品的配制

噻唑磷（fosthiazate）（纯度93.0%）為固体物质，购于德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司，准确称取适量标准物质溶解于甲醇中配成浓度为1 150 mg·L-1的标准贮备溶液;甲胺磷（methamidophos）、乙酰甲胺磷（acephate）、氧乐果（omethoate）、久效磷（monocrotophos）、

乐果（dimethoate）、敌百虫（trichlorfon）、硫环磷（phosfolan）、磷胺（phosphamidon）、敌敌畏（DDV）、杀扑磷（methidathion）、亚胺硫磷（phosmet）、内吸磷（demeton）、马拉硫磷（malathion）、三唑磷（triazophos）、灭线磷（ethoprophos）、稻丰散（phenthoate）、喹硫磷（quinalphos）、治螟磷（sulfotep）、倍硫磷（fenthion）、蝇毒磷（coumaphos）、地虫磷（fonofos）、二嗪磷（diazinon）、辛硫磷（phoxim）、伏杀硫磷（phosalone）、丙溴磷（profenofos）、特丁硫磷（terbufos）、毒死蜱（chlorpyrifos）均购于国家标准物质研究中心，此27种物质为液体标准溶液（100～1 000 mg·L-1），上述标准配制后均贮存在-20 ℃冰箱中。使用时，先将贮备液用丙酮稀释成100 mg·L-1和10 mg·L-1，再用甲醇稀释成1 mg·L-1的中间工作溶液（内含0.4%的甲酸），最后用乙腈+水（2+3）稀释成一定浓度的工作溶液。

1.3 试验所用样品的准备及处理

1.3.1 试验所用样品的准备 试验所用样品均来自青岛本地农产品例行检测过程中未检出此28种农药残留检测结果（含量低于所用方法的本实验室检出限）的样品，检测所用方法执行农业部农产品质量安全例行检测工作要求，其中噻唑磷、内吸磷、稻丰散和喹硫磷参照GB/T20769-2008方法进行检测，其它24个参数用NY/T761-2008方法检测。样品匀浆后各约1 kg，每种样品各分为10份，每份约100～150 g，于200 mL的带盖样品盒中冷冻保存，其中4份为例行检测过程中同类样品的空白试验备用，另外6份根据试验进度分别作为本实验中提取体系的选择、提取效率影响因素的分析、溶剂置换对回收率的影响、线性方程和方法有效性评价等过程中的样品或基质使用，以减少基质效应对测定的影响。在本试验开始前，4份空白试验备用样品在使用过程中未发现对空白试验有显著影响，因此所选用的试验样品能满足本试验的要求（空白试验结果见表1）。

1.3.2 试验所用样品的处理 称取匀浆样品10.00 g放入带盖子的50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入乙酸/乙腈（1∶100 Vol）溶液25.0 mL，拧紧盖子，在超声波清洗器上超声提取30 min，提取液过滤后，往滤液中加入6 g氯化钠，拧紧盖子，混匀，在快速混匀器上混匀1.5 min，最后将含有样品的聚四氟乙烯离心管放入台式离心机中以5 000 r·min-1的转速离心5 min。离心后，分取上层乙腈提取液1.00 mL于干净的小烧杯中，加入1.50 mL蒸馏水混匀，以0.22 μm针式过滤头滤膜过滤，滤液供分析用。

1.4 液相色谱条件

选用ZORBAX Eclipse  XDB C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）为分析柱。流动相组成：含2.5 mmol·L-1甲酸铵的水（A）和含2.5 mmol·L-1甲酸铵的甲醇（B）。以梯度洗脱，分别为0 min：90/10（A/B）;2 min：85/15;4 min：60/40;10 min：40/60;15 min：25/75;23 min：15/85;25 min：5/95（1.00min）;27： 90/10（A/B），27～36 min： 90/10（A/B）。流速为0.40 mL· min-1，进样5 μL，柱温40 ℃。

1.5 质谱条件

离子源为电喷雾（ESI），采用正离子模式采集数据。扫描方式为反应离子监测（MRM），干燥气温度：300 ℃;干燥气流速：8 L·min-1;雾化器压力：25 psi;鞘气温度：330 ℃;鞘气流速：9 L·min-1。电子倍增器电压增量值：400 V; 喷嘴电压为0 V。MRM离子对、裂解电压、碰撞能量、毛细管电压等参数见表2。根据28种有机磷农药的保留时间分8个时间段采集，见表3。

2 结果与分析

2.1 提取体系的选择

测定蔬菜和水果中农药残留最常用提取剂为乙腈。AOAC QuEChERS方法是用乙腈提取，并以乙酸盐缓冲液促进分配。本文以洋葱（10 g）为基质，按照1.3.2的步骤，分别采用表3中的不同提取体系进行提取。样品提取后分取1 mL乙腈提取液，自然挥干，加入1 mL甲醇和1.5 mL蒸馏水混匀，测定28种有机磷的回收率。结果（图1）表明，敌敌畏（化合物9）在8种提取体系中回收率小于38%，在含有无水硫酸钠体系中回收率小于10%;灭线磷（化合物16）在提取体系F和G中回收率小于50%;治螟磷（化合物19）、地蟲磷（化合物22）和特丁硫磷（化合物27）在体系E、F和G中回收率介于17%～46%之间;亚胺硫磷（化合物12）在体系F中回收率高达170%;其它22种有机磷在8种体系中的回收率介于50%～118%之间。综合考虑，提取体系B即用乙酸/乙腈（1：100 Vol）溶液提取，提取效果最好，所以选择此体系。

2.2 其他影响样品提取效率因素的研究

对影响样品提取效率的其他因素如冰乙酸的量、乙腈的体积，快速混匀器上混匀的时间，震荡提取和超声提取时间进行了优化，这几个因素优化后的最佳量化值为乙酸/乙腈（1∶100 Vol）溶液25 mL，超声30 min后，快速混匀器上混匀振荡1.5 min。综合本节与2.1的结果，以洋葱10 g为基质，按1.3.2步骤进行测定，28种有机磷的回收率均在70%～120%范围内。

2.3 溶剂转换对28种有机磷农药回收率的影响

一般在进行HPLC-MS/MS分析样品时，通常样品提取后，需要将溶剂转换成与流动相相同的溶剂，以取得最佳的色谱峰型。试验表明，尽管用甲醇+水（2+3）做溶剂，有机磷农药的色谱峰最佳，但将提取体系的溶剂由乙腈转换成甲醇后，敌敌畏、治螟磷、特丁硫磷、地虫磷、灭线磷和二嗪磷6种农药的损失很大，回收率在15.8%～61.5%之间，特别是敌敌畏、治螟磷的回收率不足20%。但如果溶剂为纯乙腈，甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果的总离子流峰会出现双头峰，为改善3种农药的色谱峰型，本文比较了用不同比例的乙腈水做溶剂对色谱峰型的影响。结果表明，乙腈水的比例为2+3时，色谱的峰型较好，尽管他们的色谱峰没有甲醇+水（2+3）做溶剂的好，但6种农药的回收率有较大的提高。故本文最终选择乙腈水（2+3）做溶剂。

2.4 线性范围、线性方程及相关系数

28种有机磷农药在不同的基质中，表现出的基质效应也不一样，为了减少基质效应对测定的影响，本研究采用基质标准曲线作为定量曲线。在仪器的最佳测定条件下，洋葱基质中28种有机磷农药的线性回归方程见表4，在0.200～100 μg·L-1的浓度范围内，权重采用（1/X），有机磷农药的含量与峰面积之间的相关系数在0.998 27～0.999 90范围内。

2.5 方法有效性的评价

分别称取10.00 g未检出28种有机磷农药残留的洋葱样品，28种有机磷农药的加标浓度为10.0，50.0，200 μg·kg-13个水平，测定结果见表5，标准物质的MRM质谱图和洋葱加标样品的MRM质谱图见图2。由表5可知， 28种有机磷6次测定的平均回收率在76.4%～102.6%，相对标准偏差在1.3%～8.1%之间，试验结果表明回收率符合农药残留检测实际要求。

向7个洋葱样品中分别添加浓度为3 μg·kg-1的28种有机磷农药，按照所建立方法的样品全部分析步骤进行测定，计算方法检出限（MDL）=S×3.143，式中的S为7次测定值的标准偏差。28种有机磷农药残留的检出限在0.06～0.89 μg·kg-1 范围内，定量限在0.24～3.6 μg·kg-1。根据GB2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》的规定，鳞茎等类蔬菜中28种有机磷农药有规定的最大残留限量值均在0.01 mg·kg-1及以上（表1），因此，所建立的分析方法完全能够满足28种有机磷农药痕量残留量分析的要求。

分别称取葱、蒜、韭菜及姜各8份样品，2份样品作为空白，6份样品加入浓度水平为10.0 μg·kg-1的28种有机磷农药，利用所建立方法的提取、检测步骤测定相关农药的量。结果（表6）表明，葱、蒜、韭菜及姜4种基质中28种有机磷农药的平均回收率均在74.7%～109.9%，相对标准偏差在0.54%～6.3%之间;其中，作为基质的姜样品中检出了噻唑磷，2份空白样品测定的平均含量为12.1 μg·kg-1，6份加标样品测定的结果在扣除空白样品的测定值后，平均回收率为101.7%，6份加标样品测定结果的RSD 为1.8%，结果完全符合GB2763-2019的相关要求，这从侧面证实了本方法的有效性和准确性，而且检出限更低。

3 结 论

本研究以乙酸/乙腈（1：100 Vol）+6 g氯化钠为提取体系，用基质校正液相色谱三重四级串联质谱建立了同时测定洋葱、葱、姜、蒜及韭菜中28种有机磷农药残留量的测定方法。试验结果表明：28种有机磷农药在0.200～100 μg·kg-1质量浓度范围内成线性关系，相关系数在0.998 27～0.999 90;方法检出限在0.06～0.89 μg·kg-1之间，方法定量限在0.24～3.6 μg·kg-1 范围内。洋葱中28种有机磷农药残留量在10.0，50.0，200 μg·kg-13个浓度水平的平均回收率在76.4%～102.6%之间，相对标准偏差在1.1%～9.0%之间;葱、姜、蒜及韭菜中28种有机磷农药残留量在10 μg·kg-1浓度水平的平均回收率在74.7%～109.9%之间，相对标准偏差在0.61%～6.2%之间。上述方法解决了基质干扰问题和一些有机磷农药回收率低的问题，方法准确度高，灵敏度好，简单、快速。

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