纳米二氧化钛在组织工程应用中的研究进展

庄秉琪，向海樱，陈建明，黄华荣

(杭州师范大学生命与环境科学学院，发育与再生重点实验室， 浙江 杭州 311121)

0 引言

组织工程是以细胞生物学和材料科学的理论及前沿技术为基础，在体内外构建人体组织或器官用于替代治疗的一门学科.目前体外器官培养面临的困难主要是其三维结构的生成.平面的单层细胞体外人工培养分化技术已经日趋成熟，如何从二维的单层细胞向三维组织构成发展是体外器官培养的关键.覆盖有纳米二氧化钛的材料不仅能够建立促进干细胞增殖分化、可塑性极强的空间架构，而且可以被光电信号人为诱导改性，从而实现在立体空间层面的调控.根据这一领域的研究进展，本文将从以下3方面展开论述，展示纳米二氧化钛材料的组织工程应用价值.包括1)纳米二氧化钛的特殊结构制作方法及特点； 2)特殊结构纳米二氧化钛在组织工程中的应用；3)相比其他传统的组织工程材料，纳米二氧化钛的优缺点.

1 特殊结构纳米二氧化钛的制作方法及特点

1.1 纳米二氧化钛管阵

由于良好的生物相容性[1]，无论是应用于体外细胞培养还是体内组织修复，纳米二氧化钛管阵结构都是最具影响力的纳米二氧化钛的特殊结构.覆盖于钛片表面紧密排列的圆柱体空心二氧化钛管可以有效吸附环境基质中的蛋白质等分子，并对黏附其上的细胞产生诸多的生物学影响.目前纳米二氧化钛管阵的制作方法主要有阳极氧化法、模板合成法和水热合成法.考虑到制作过程应介入有效的人为调控因素，实际有应用价值的制作方法只有阳极氧化法.

1.1.1 阳极氧化法制作纳米二氧化钛管阵

所谓阳极氧化纳米二氧化钛膜是以抛光Ti片作为阳极，碳作为阴极，在电解液中进行氧化[2].钛阳极整个氧化过程大致分为3个阶段：初级阶段是阻挡层的形成阶段，在钛表面形成致密的TiO2薄膜；第二阶段是多孔层的初始形成阶段,表面氧化层形成,膜层承受的电场强度急剧增大, TiO2阻挡层发生随机击穿溶解,形成孔核,随着氧化时间的增加,孔核发展成为小孔,均匀分布在表面；第三阶段是多孔膜层的稳定生长阶段，孔与孔之间TiO2不断溶解,最后形成管壁.当氧化层的生成速度与溶解速度平衡时,纳米管长度达到最大值,这种平衡取决于阳极氧化电压[3].最终会在纯钛表面形成均匀的纳米二氧化钛管阵.针对含F电解液会使得生成的纳米管排列不均匀的问题，Xing[4]使用了一种含有BF4的电解液，进行TiO2纳米管的制备后发现，相较于传统的电解液，它可以使纳米管阵形成更有序，此外乳酸或葡萄糖酸的加入也可使得纳米管阵更整齐完整.由于这种独特的结构具有丰富的生物学效应，因此极大地扩展了其在组织工程中的应用.

1.1.2 模板合成法

该方法以异丙醇钛盐为原料,通过压力浸入法使得异丙醇钛盐进入多孔氧化铝模板内部,然后在500 ℃高温氧化分解孔内反应物,如此反复多次之后即可获得直径50～70 nm的锐钛矿相TiO2纳米管阵列,所合成纳米管管口与氧化铝模板多孔形状有较强的依赖关系[5].但该方法受模板限制较大、工艺复杂、易形成纤维状的TiO2结构，在组织工程上难以应用.

1.1.3 水热合成法

碱性水热合成过程中TiO2纳米管形成的可能机理是层状纳米片的卷曲[6],发生卷曲的动力源自结晶和扩展过程中所形成的应力[7].随着水热处理温度的升高(120～150 ℃),所合成纳米管的直径增大,温度继续提升则形成实心纳米纤维状结构.另外随着TiO2与NaOH摩尔比的增大,纳米管平均直径增大而比表面积减少.由于水热合成的纳米TiO2杂乱无章，难以人为调节，因此在实际的组织工程中没有应用价值.

1.2 壳核结构纳米二氧化钛

制作壳核结构纳米二氧化钛有水热合成法及化学液相沉积法[8].这种空心的纳米颗粒可以使负载的药物缓释，与Fe3O4结合的壳核纳米TiO2还可以受磁场的引导进行移动[9].

1.2.1 水热合成法

利用化合物在高温高压水溶液中的特殊性质可以制作壳核结构纳米二氧化钛.以制备TiO2/Al2O3核壳型纳米粉体材料[10]为例,该工艺的关键之处在于核壳型纳米粉体前驱物的获得,即得到包膜完好的Ti(OH)4/Al(OH)3, Al(OH)3完整地成膜包覆在Ti(OH)4的外表面.尽管制备的纳米级TiO2颗粒发育完整且分布均匀，但是合成需要高温高压，具有风险且成本高，并不适合实际的生产使用.

1.2.2 化学液相沉积法

将含有Ti4+和掺杂离子的溶液按一定的配比配制成溶液,添加过量的沉淀剂，在沸腾或水解的条件下进行搅拌.由于沉淀离子的浓度大大超过沉淀平衡浓度,从而使两种离子能够同时按比例沉淀下来,得到较均匀的沉淀物.沉淀可以是氢氧化物或水合氧化物,也可以是其他难溶盐,最后将沉淀脱水或者焙烧分解而得到包覆有氧化物膜层的纳米TiO2粉体.这种方法可以有效控制壳核结构的厚度并且十分简便，适用于大规模生产.

1.3 掺杂稀土元素的光响应纳米二氧化钛颗粒

纳米二氧化钛在紫外光照射下其表面由于电子-空穴效应使其具有催化活性，此外二氧化钛的禁带宽度较宽(3.2eV),其光谱吸收范围很窄,稀土原子掺杂二氧化钛可以明显拓宽光谱响应范围，使其吸收波长向可见光方向移动.Zhang[11]对比Gd、Ce掺杂发现Gd掺杂的Gd-TiO2光催化活性明显高于Ce掺杂的Ce-TiO2,稀土掺杂虽然宏观上都可以使得TiO2的禁带宽度变窄，但这并不是提高其可见光催化活性的决定性因素，而与掺杂调节禁带宽度的机制有关，对于Gd和Ce等稀土元素而言，内建电场的作用要大于杂质能级的作用.

水热合成法或者溶液凝胶法都可以用于制作掺杂稀土元素的纳米二氧化钛颗粒，有价值的是这种颗粒受紫外光照射产生的催化活性还会使黏附的细胞发生脱离，这样就让人为的光响应调控细胞黏附成为可能.

2 特殊结构纳米二氧化钛的组织工程应用

上述这些特殊结构的纳米二氧化钛材料在组织工程上的应用主要包括药物分子的缓释、细胞增殖分化的调控以及细胞黏附的光响应调节3个方面.

2.1 药物分子的缓释

药物缓释技术在再生医学和组织工程中有着重要的作用.目前药物缓释材料在组织工程领域最常见的为凝胶类物质，凝胶具有良好的可塑性以及对药物的高吸附性，且对生物体无毒.Hou[12]等人研究合成了一种可光交联的水溶性羧甲基壳聚糖衍生物，该水凝胶高度孔隙化且孔隙之间相互连通，孔径在1～20 μm范围内，并且在溶菌酶作用下缓慢降解，测试中对抗癌药物吉西他滨具有缓释作用，药物释放时间可达4 d.另外有研究使用冷冻干燥法制备丝素/海藻酸钠复合支架，测试负载盐酸万古霉素发现当丝素/海藻酸钠载药质量比为60/40时，载药率为7.6%±1.5%，但是缓释时间在80～100 h之间.根据多空结构的聚乳酸可以作为促进细胞无差别增殖的材料[13]，为进一步实现其药物负载缓释，Yang[14]采用静电纺丝技术制备了载药阿司匹林/聚乳酸(PLA)/聚乙烯吡咯烷酮(PVP)复合纳米纤维,缓释时间为30 h左右.

利用特殊结构的纳米二氧化钛来构建缓释结构体系是更为有效的解决方案.以再生人体损伤骨骼为例，为了控制骨骼伤口处的炎症反应往往需要药物的辅助，但是全身给药的弊端是针对性差、药物体内降解快.阳极氧化形成的纳米二氧化钛管是在纯钛片的基础上形成的，其上端是开放的圆口，内部中空，可以将药物分子填充其中.经过纳米二氧化钛负载的药物可以有针对性地作用在需要的部位，在纳米二氧化钛的管口处再覆盖可降解材料即可使得药物分子在人体内的释放减缓，达到药物的持续释放以及延长药物的有效作用时间，手术植入物的炎症反应因此得到有效地改善.

白藜芦醇介导的细胞信号通路已经基本明晰[15].为了强化其治疗效果，Yan[16]进行了以负载抗氧化药物白藜芦醇的纳米二氧化钛膜机制研究，发现其通过抑制NF-kB信号通路来抑制巨噬细胞炎症反应，并促进间充质干细胞(MSC)分裂分化为骨细胞.数据显示在62 nm管径纳米二氧化钛管阵中，5～15 mg/cm2浓度下第1天释放率为96%，第3天则完全释放.虽然缓释效果与凝胶相比不具优势，但是其对作用部位的集中效应使得MSC周边的巨噬细胞炎症反应被持久抑制.有研究发现巨噬细胞的M1型极化[17]被抑制，共同阻止了炎症的加剧，非常有利于MSC细胞的成骨分化及受损骨骼的再生.

在研究药物的持久释放方面的例子还有米诺环素[18]，以壳多糖作为纳米二氧化钛管的封口，结合不同管径的纳米二氧化钛管阵，均可在不同程度延长药物的释放时间.壳多糖可以自然降解，不影响管中药物的药效，同时可以减缓药物释放的速度，是理想的控制释放材料.通过释放曲线等实验发现， 70 nm 管径的纳米二氧化钛的载药量最高，至15 d仍有少量释放，缓释效果最佳.

此外Zheng[19]等以TiO2纳米管阵列/介孔羟基磷灰石(m-HA)复合型药物载体吸附阿仑膦酸钠，缓释8 d后总释放率达到(97.31±8.22)%，并且载药量大于无m-HA的纳米二氧化钛.Song[20]在盖聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)涂层的纳米二氧化钛上，由透明质酸(HA)层和负载ICA的壳聚糖(CS-ICA)层通过层层自组装形成的复合涂层，以此负载淫羊藿苷，最大可以缓释2周，且具有促进干细胞分化的效果.

壳核结构的纳米二氧化钛颗粒也可以进行药物的缓释，并且能在磁场下人为地引导移动，非常适合体内的组织再生使用.通过水热碱法工艺可以在二氧化硅的基础上包覆TiO2形成纳米二氧化钛的空心颗粒，例如Xu[21]先用Fe3O4颗粒覆盖二氧化硅，再叠加TiO2层，最后溶去二氧化硅后得到夹心的纳米TiO2&Fe3O4颗粒.这种壳核结构的颗粒在负载药物后有明显的缓释能力，24 h释放70%的药物，并且由于Fe3O4的磁性，这些颗粒可被人为的磁场诱导移动，给药物精准投递提供了方便.在一段时间内保存药物并定点集中释放的能力展示了壳核颗粒的独特医疗应用前景.此外其在体外的器官培养中还能达到定点的刺激和诱导细胞分化的作用.

2.2 细胞增殖分化的调控

阳极氧化得到的纳米二氧化钛管阵的管径大小、高度及排列方式都对干细胞的黏附、增殖分化有影响.在不同的实际需求中要有合适的设计结构来满足特定的要求.近来围绕纳米二氧化钛的管阵结构参数优化研究取得了诸多成果.

Zhang[22]利用小鼠骨髓间充质干细胞测试30、50、100 nm管径的纳米二氧化钛管阵对细胞成骨分化的影响，发现随着纳米管管径的增大，细胞内成骨相关基因表达水平逐渐升高，ALP 合成、胶原分泌和矿化水平也逐渐增强.得出小管径促进分裂，大管径促进伪足延伸和细胞分化的结论.

在管阵结构方面Li[23]等人利用光刻技术与阳极氧化技术制作了3种纳米二氧化钛管阵结构：单纯管阵、管阵与纯钛表面相间排列以及长管形态的管阵与较短的管阵相间排列.在其上培养间充质干细胞与内皮细胞，观察到长管与短管阵相间排列的表面最利于间充质干细胞分化为收缩型平滑肌细胞，该类结构表面对内皮细胞的黏附分裂效果也是最好的.

研究已经表明管径小于30 nm的纳米二氧化钛管有利于细胞的生长分裂，管径大于70 nm则会使细胞的伪足延伸，整体细胞的形态拉长，分化效率显著提升.Qiu[24]在钛片上利用光滑TiO2部分与氧化的纳米管阵相间排列，在成骨分化培养基上培养，发现在管阵上促进MSC分化为骨细胞，而光滑部分仍为MSC，为定点分化植入体表面接触的细胞提供了新思路.

常温制备的TiO2纳米管为非晶态，经过特定温度退火处理，TiO2晶型结构转变为锐钛矿或金红石.一般情况下，400～600 ℃的退火可形成锐钛矿相，600～750 ℃的退火则形成金红石相.晶体结构改变不会影响纳米二氧化钛本身的管阵结构，但是其晶体构象和性质会对接触细胞产生一些生物学上的影响[25]，Li[26]等发现TiO2纳米管会抑制成纤维细胞的黏附和增殖,退火处理可增强这种抑制效果.有趣的是退火处理会抑制纳米二氧化钛管阵上的细胞分泌胶原蛋白，而促进纯钛表面的细胞分泌胶原蛋白.

由于大管径的纳米二氧化钛管阵可以抑制细胞的分裂，Desai[27]制作了管径90 nm的纳米二氧化钛管阵，分别接种炎症因子诱导的内皮细胞(EC)与平滑肌(SMC)细胞，观察到纳米二氧化钛表面通过减少细胞黏附和细胞扩散面积而降低了SMC覆盖率.此外，在纳米二氧化钛管阵上培养的两种细胞的炎症反应显著降低.纳米TiO2表面减弱了TNFα诱导的SMC增殖，以及TNFα诱导的EC黏附分子表达.90 nm管径纳米TiO2的表面也降低了SMC的细胞运动，与30 nm和50 nm的TiO2管阵相比，90 nm的管阵组，SMC覆盖率和炎症反应的抑制效果最佳.众所周知，动脉手术后受炎症刺激SMC发生表型转化及增殖都会导致血管的再狭窄，用覆盖90 nm管径的纳米TiO2管阵的血管支架取代药物洗脱支架可为这类手术提供新的材料和思路.

巨噬细胞的黏附与表型受材料表面形貌和亲水性影响[28]，形貌的作用在同为超亲水的不同管径纳米二氧化钛间更为关键.Ma[29]等发现30 nm管径的纳米二氧化钛管阵会使得巨噬细胞的形态缩小为盘状，并且减少黏附.80 nm的管径则有利于巨噬细胞的黏附延伸，各个细胞的伪足彼此交汇，有很强的移动力.这种变化与纳米二氧化钛吸附的蛋白状态有关[30]，30 nm管径表面的巨噬细胞表型偏向于M2极化，80 nm则是促进M1极化.虽然两者在体外与MSC培养的过程中差异不大，但是在体内的实验显示由于80 nm组巨噬细胞M1极化导致炎症反应加强，不利于MSC的成骨分化.因此小管径的纳米二氧化钛表面管阵是更好的植入物覆盖材料[31].

在纳米二氧化钛与传统组织工程材料差异比较研究方面，Wang[32]将聚癸二酰甘油酯(PGS)接枝马来酸轩(MAH)制备成一种可降解的新型高分子材料(PGS-M)，并进一步将PGS-M与纳米羟基磷灰石(n-HA)制备成兼具两者优点的复合支架材料,弥补PGS-M在力学性能上的不足.PGS-M-n-HA系列复合支架材料孔径、孔隙率加大有利于细胞的迁移和黏附，在室温和体温下都能表现出较好的弹性及热稳定性，降解时间上呈线性关系，有利于体内的骨骼再生.但是其作用对象只有成骨分化的间充质干细胞，并不能做到纳米二氧化钛一样的广泛效应，而且也不能兼具药物缓释的功能，下一个例子也是同理.Ji[33]利用永久性骨植入物聚醚醚酮(PEEK)[34]制作了微球状的骨骼再生填充物，与可降解羟基磷灰石/聚(乳酸-乙醇酸)(HA/PLGA)微球[35]共同使用，克服其降解速率难以调控的技术难点，降低降解副产物对骨重建微环境的影响.这种微球材料可以减少手术过程的创伤，为骨骼再生提供支架[36].

总的来说，纳米二氧化钛对不同类型的干细胞影响是趋于一致的，对干细胞的增殖和分化是促进或抑制是具有普遍规律的，而其他材料一般只对某些干细胞的分化或增殖有特定的影响.纳米二氧化钛这一通性优点，无论是应用于再生骨骼还是修复血管都能发挥良好的作用.此外该材料对细胞的有益干预也是其优势所在，比如它能够通过有效抑制巨噬细胞的炎症反应来促进干细胞的增殖，有利于后期的分化.

2.3 细胞黏附的光响应调节

纳米二氧化钛颗粒对紫外线有特殊的响应，其表面结构会产生变化，而掺杂稀土元素[37]可以有效改进光响应的波长范围，更宽的响应波长可以减少对细胞的伤害，也更方便实际操作.

使用溶液凝胶法[38]制备的纳米二氧化钛膜具有良好的光响应特点，紫外光下形成电子-空穴，空气中的水解离吸附，形成表面羟基[39]，使得TiO2表现为超亲水性.吸附于表面的蛋白质构象发生改变，α螺旋和卷曲会转变为β折叠，促使黏附的细胞脱落.但是这个过程需要高能的紫外线，对细胞有伤害，且光的利用率不高，为此Zhu[40]等人在掺杂Eu的纳米二氧化钛纳米颗粒基础上，进行实验发现光响应的激发光波长范围扩大，对光的利用增加，电子-空穴的复合时间从原始的90 ms延长至4 660 ms，细胞脱离比例超过90%.

为了使纳米二氧化钛颗粒能够与细胞培养皿结合，利用PDA进行改性使得培养皿PS板有了良好亲水性[41]，更易于与TiO2结合.该复合材料不影响紫外线的透过，使得光响应过程可以顺利进行.此研究实现了细胞的原位分离，即通过光照控制培养细胞的黏附与脱落，为未来器官组织体外培养的精细调控打下基础.

3 总结

尽管有研究表明，大量颗粒纳米二氧化钛注射入血液后会对脑、肝以及肠胃等器官造成伤害，颗粒纳米二氧化钛对斑马鱼胚胎的发育实验[42]也显示超过1 μg/L的颗粒纳米TiO2会延迟胚胎的发育，小鼠肺部的颗粒纳米二氧化钛滴注实验表明TGF-β/Smad/p38MAPK/Wnt信号通路被颗粒纳米TiO2诱导的自由基激活并最终导致肺部纤维化[43]，但是，本质上这些伤害都是经大量的颗粒纳米二氧化钛介导.我们无需担心在组织工程中使用特殊结构的纳米二氧化钛带来的负面效应，因为这些特殊结构的纳米TiO2在生物体内是不可分解的整体，它并不会以纳米颗粒的形式进入血液.

相比传统组织工程材料，特殊结构的纳米二氧化钛对于干细胞分化和增殖具有独特的通性影响.尽管作为金属氧化物在体内难以被降解，除了作为骨骼再生的永久植入物以外，它还可以与其他的可降解有机物材料复合，方便后续手术取出.不容忽视的是该材料还有其独特的性质，借助紫外线来控制黏附于表面的细胞脱落，这种光响应不但可以帮助植入体内支架的取出，而且在体外的细胞研究中可以实现细胞的原位脱离.纳米二氧化钛是覆盖在纯钛上的表面膜，这一结构特点使得其在体外的单层细胞培养中已有诸多的应用.在此基础上如何将其构建成特定的三维支架是目前组织工程临床应用的关键.总之，实现纳米二氧化钛与其他的材料完美结合并构建出特定的空间结构，将极大推动其作为优秀的支架材料在组织工程上的临床应用范围和进程.