FGF-21缓解阿霉素诱导的大鼠心肌炎症反应和凋亡作用机制研究

李德山 , ，王宗宝，康 凯，任桂萍，于 丹

（1. 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222002）

阿霉素（Doxorubicin，DOX）是临床上用于治疗各类恶性肿瘤的蒽醌类高效广谱化疗药物[1]，但剂量依赖心脏毒性副作用限制其临床应用，主要体现在心肌损伤[2]。近年来，针对阿霉素心脏毒性研究发现，DOX 诱导心肌细胞炎症和凋亡方面在毒性机制中发挥重要作用[3]，包括激活心肌细胞凋亡信号通路，线粒体功能紊乱，心功能下降等，揭示该类疾病具有复杂的发病机制[4]。阿霉素可激活NF-κB 通路，引起下游如IL-6 等炎症介质释放，引发心肌细胞炎症反应[5]。此外NF-κB通路激活也可能促进凋亡[6]，进一步引起心肌损伤。其他研究发现阿霉素可通过Nrf2 通路上调caspase-3 和bax表达，下调bcl-2表达，引起心肌细胞凋亡造成心肌损伤[7]。同时STAT3信号通路在心肌凋亡方面发挥重要作用，激活STAT3 通路可抑制阿霉素诱导的心肌细胞凋亡[8]，为缓解阿霉素毒副作用机制研究提供理论基础。

成纤维细胞生长因子-21（Fibroblast growth factor 21，FGF-21）是由209 个氨基酸组成的内分泌蛋白[9]，目前，已知FGF-21 在降血糖[10]、降血脂、调节能量代谢、抗氧化应激、抑制炎症[11]、抑制器官纤维化[12]和抑制血小板活化[13]等方面效果明显。FGF-21可通过SIRT1/LKB1/AMPK信号通路抑制心肌细胞的氧化应激、炎症和细胞凋亡[14]。除此之外，FGF-21缓解DOX诱导心脏毒性作用的机制与NF-κB 和STAT3 通路之间的关系尚无报道。本研究利用DOX 所诱导的大鼠心肌损伤模型，探究FGF-21 对该大鼠模型的保护作用，进一步探究FGF-21缓解DOX诱导的大鼠心肌炎症反应和凋亡过程中发挥的作用，同时明确FGF-21缓解DOX诱导大鼠心肌损伤过程中对NF-κB 和STAT3 通路作用。本研究为FGF-21缓解DOX诱导大鼠心肌损伤预防机制研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

pSUMO-FGF-21重组质粒、E.coli Rosetta 表达菌株和H9C2细胞均保存自东北农业大学生命中心生物制药实验室；SUMO蛋白酶制于东北农业大学生命中心生物制药实验室[15]。

1.2 试剂与器材

盐酸阿霉素（DOX）购自都莱公司；血糖仪、血糖试纸购自青岛厚美德公司；Rat IL-1β、Rat IL-6和Rat TNF-α ELISA试剂盒均购自北京安迪华泰科技有限公司；兔抗bcl-2、Caspase-8抗体购自Abcam公司；兔抗β-actin抗体、兔抗bax抗体、鼠抗stat3抗体、兔抗P-stat3抗体、兔抗Caspase-3抗体、兔抗P-NF-κB 抗体、兔抗NF-κB 抗体和兔抗GAPDH 抗体购自Cell Signaling 公司；HRP 羊抗鼠抗体和HRP 羊抗兔抗体购自R&D；Western quick block kit 购自Genescript 公司；一抗稀释液、二抗稀释液和一抗二抗去除液均购自碧云天公司。

1.3 引物序列

Rat 引物序列由Sangon Biotech 合成： IL-6（ 上 游： AGCGATGATGCACTGTCAGA； 下 游：TAGCACACTAGGTTTGCCGA）， IL- 1β（ 上 游：GACTTCACCATGGAACCCGT； 下 游： GGAGACT GCCCATTCTCGAC），TNF-α（上游：GATCGGTCC CAACAAGGAGG；下游：GTGAGGAGCACATAGT CGGG）， GAPDH（上游： AGTGCCAGCCTCGTCT CATA；下游：GATG GTGATGGGTTTCCCGT）。

1.4 实验动物

C57BL/6 雄性小鼠20 只，20～25 g，购自北京唯尚立拓科技有限公司，合格证号：NO.11036419 11001109，许可证号：SCXK（京）2016-0009；10月龄SD 雄性大鼠25 只，约230～270 g，购自长春亿斯实验动物有限公司。

1.5 方法

1.5.1 FGF-21蛋白发酵表达与纯化

将pSUMO-FGF-21重组质粒转化E.coli Rosetta表达菌，37 ℃过夜培养，挑取单菌落接种于氨苄抗性（100 μg·mL-1）20 mL LB 液体培养基，37 ℃培养6～8 h 后，SDS-PAGE 凝胶电泳检测菌体上清中SUMO-FGF-21蛋白表达。按1%接种量接种于2个氨苄抗性（100 μg·mL-1）250 mL LB 液体培养基，120 r·min-1，37 ℃培养，当菌体OD600达到2时，作为发酵一级种子。以1%接种量接种于5 L 培养基发酵罐中培养，温度37 ℃，pH 7，溶氧百分比为30%，当菌体OD600达到7时，取少量菌液制作蛋白样品，温度调至25 ℃，加入IPTG（0.25 mmoL·L-1）诱导培养6 h[16]。收集菌液，取少量菌液制作蛋白样品，剩余菌液，温度4 ℃，4 000 r·min-1离心，弃上清，将菌体沉淀用磷酸盐缓冲液搅拌均匀倒入高压匀浆机破碎，离心后收集上清并经中空纤维柱澄清。运用AKTA purifier100 纯化系统纯化，利用His Trap TM FF crude 亲和层析柱一次亲和得到SUMO-FGF-21， Hi Prep TM 26/10 Desalting脱盐柱脱盐后，加入SUMO 蛋白酶4 ℃过夜酶切。再利用His Trap TM FF crude 亲和层析柱二次亲和，脱盐后得到成熟FGF-21 蛋白。15%蛋白凝胶电泳分析蛋白纯化情况。

1.5.2 FGF-21蛋白活性鉴定

为检测FGF-21 蛋白活性，糖尿病模型组和FGF-21组C57BL/6 小鼠按照100 mg·kg-1腹腔注射一次STZ，正常对照组注射等量生理盐水，根据血糖变化情况每天测量血糖，直至高血糖趋势稳定[16]。每日FGF-21 组注射FGF-21 蛋白，注射剂量为1 mg·kg-1。注射前和后2、4 h 分别取各组小鼠尾尖血，血糖仪检测血糖。

1.5.3 心肌损伤大鼠模型建立

SD 大鼠随机分成正常对照组（Control）、心肌损伤模型组（Model）、 FGF- 21 高剂量组（FH）、FGF-21 中剂量组（FM）、FGF-21 低剂量组（FL）5 组。利用PBS 将DOX 配制成2 mg·mL-1工作液，除Control组外其余各组SD大鼠于每周1、3、5、7日均尾静脉注射2 mg·kg-1DOX 工作液，Control 组给予等量生理盐水，同时FH、FM和FL组从第1次注射DOX 工作液开始每天腹腔注射FGF-21 蛋白，剂量分别为5、2 和1 mg·kg-1，注射4 周，直至大鼠处死[17]。处死大鼠时，取各组大鼠心脏组织，一部分心脏组织浸泡于4%多聚甲醛，一部分组织保存于-80 ℃；胸、腹腔积液2 000 r·min-1，4 ℃，离心10 min保存于-80 ℃。

1.5.4 Real-time PCR检测炎症因子转录水平取-80 ℃保存的各组大鼠心脏组织0.1 g，Trizol 法提取总RNA，反转录为cDNA，作Realtime PCR扩增，每组3个平行反应。具体循环参数为：95 ℃预变性10 s，95 ℃5 s，60 ℃退火30 s，40 个循环后记录数据。引物序列：IL-6（上游：AGCGATGATGCACTGTCAGA； 下游： TAGCACA CTAGGTTTGCCGA），IL-1β（上游：GACTTCA CC ATGGAACCCGT； 下游： GGAGACTGCCCATTCTC GAC），TNF-α（上游：GATCGGTCCCAACAAGGA GG；下游：GTGAGGAGCACATAGTCGGG），GAPDH（上游：AGTGCCAGCCTCGTCTCATA；下游：GAT GGTGATGGGTTTCCCGT）。

1.5.5 阿霉素诱导心肌损伤大鼠相关炎症因子指标测定

取-80 ℃保存各组大鼠心脏组织0.1 g，加入1 mL生理盐水匀浆，低温离心机中2 000 r·min-1离心20 min后收集上清液体；取-80 ℃保存各组大鼠胸、腹腔积液，按照ELISA试剂盒说明书操作。

1.5.6 Western blot检测相关蛋白指标

取-80 ℃保存各组大鼠心脏组织约0.1 g，加入RIPA 裂解液1 mL，组织匀浆机充分匀浆，4 ℃裂解1 h 后，12 000 r·min-1离心10 min，收集上清。总蛋白经SDS-PAGE 分离后，转移到NC 膜上，Western quick block kit 封 闭5～10 min， PBS 洗 膜5 s，分别加入一抗，4 ℃孵育过夜。次日，PBST洗膜3次，每次10 min，HRP标记羊抗兔二抗室温避光孵育1 h（鼠抗stat3 抗体孵育的膜应用HRP 标记羊抗鼠二抗避光孵育1 h），PBST 洗膜3 次后化学发光法显影，采用Image Lab 6.0软件分析条带。

1.5.7 HE和Masson染色病理检测

处死大鼠时取各组大鼠心脏部分组织，浸泡于4%多聚甲醛，送南京中西医结合医院病理科作病理组织切片。

1.5.8 阿霉素诱导H9C2心肌细胞损伤模型建立

H9C2 细胞分成正常对照组（Control）、模型组（Model）、FGF-21 高剂量（80 μg·mL-1）组（FH）、FGF-21中剂量（40 μg·mL-1）组（FM）、FGF-21低剂量（20 μg·mL-1）组（FL）。利用生理盐水将DOX配制成终浓度5 μg·mL-1工作液， FH、FM和FL组预先用FGF-21干预2 h，剂量分别为80、40 和20 μg·mL-1，Model 组与FH、FM、FL 组同时用5 μg·mL-1DOX工作液刺激H9C2 细胞22 h，Control 组用同体积生理盐水处理[14]。利用各组细胞制作蛋白样品，作Western blot检测，具体步骤见1.5.6。

2 结果与分析

2.1 SUMO-FGF-21发酵表达

将一级种子接入发酵罐，37 ℃发酵培养4 h，25 ℃、0.25 mmoL·L-1IPTG条件下诱导培养6 h，通过蛋白凝胶电泳分析蛋白表达情况。结果见图1，1号泳道诱导前菌种无SUMO-FGF21蛋白表达，2号泳道诱导后全菌有SUMO-FGF21蛋白表达，3号泳道诱导后上清有SUMO-FGF21蛋白表达，4号泳道诱导后沉淀有SUMO-FGF21 蛋白表达。SUMOFGF21蛋白发酵表达成功。

2.2 FGF-21蛋白纯化

运用AKTA purifier100 纯化系统纯化FGF-21蛋白，结果如图2 所示，1 号泳道为最终纯化所得FGF-21蛋白，约23 ku，且无杂蛋白。

2.3 FGF-21蛋白生物学活性体内检测

为鉴定FGF-21 蛋白活性，将纯化所得FGF-21 蛋白注射于STZ 诱导的糖尿病小鼠模型体内，如图3 所示，注射FGF-21蛋白前，糖尿病模型组和FGF-21组小鼠血糖水平无显著差异。注射FGF-21蛋白2 h后，FGF-21组小鼠血糖浓度明显降低，较糖尿病模型组差异极显著（P＜0.01）。注射FGF-21 蛋白4 h 后，FGF-21 组小鼠血糖浓度明显降低，较糖尿病模型组差异极显著降低（P＜0.01）。结果表明，FGF-21蛋白降血糖蛋白活性较好。

2.4 FGF-21对阿霉素诱导后大鼠体重的影响

如图4a 所示，造模前各组大鼠体重均处于相同水平。造模1个月后，与正常对照组相比，模型组、FGF-21 高、中和低剂量组大鼠总体重极显著降低（P＜0.01）。如图4b 所示，造模1 个月后，各组大鼠除去胸、腹腔积液，与正常对照组相比，模型组大鼠体重极显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，FGF-21 高剂量组大鼠体重降低缓慢，差异显著（P＜0.05）。如图4c 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠胸、腹腔积液极显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，FGF-21 高剂量组大鼠胸、腹腔积液显著降低（P＜0.05），FGF-21 中、低剂量组大鼠积液无显著变化。FGF-21 呈剂量依赖性显著缓解阿霉素诱导大鼠后体重降低，减少阿霉素诱导大鼠胸、腹腔积液产生。

2.5 FGF-21 对阿霉素诱导心肌损伤大鼠心脏TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平的影响

如图5a 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠TNF-α mRNA 表达水平极显著升高（P＜0.01）；与模型组相比， FGF- 21 高剂量组大鼠TNF- α mRNA显著降低（P＜0.05），与正常对照组水平无显著差异，FGF-21中、低剂量组大鼠无显著差异。如图5b 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠IL-1β mRNA 表达水平极显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，FGF-21高、中剂量组大鼠IL-1β表达均显著降低（P＜0.05），FGF-21 低剂量组大鼠无显著差异。图5c 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠IL-6 mRNA 表达水平极显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，FGF-21高剂量组大鼠IL-6表达显著降低（P＜0.05），FGF-21 中、低剂量组大鼠无显著变化。结果表明FGF-21可呈剂量依赖性降低阿霉素诱导大鼠心脏IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达。

2.6 FGF-21 对阿霉素诱导心肌损伤大鼠心脏TNF-α、IL-1β和IL-6表达的影响

如图6a 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠TNF-α 表达极显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，FGF-21高、中、低剂量组大鼠TNF-α表达均显著降低（P＜0.05），与正常对照组水平无显著差异。如图6b 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠IL-1β 表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，FGF-21 高、中、低剂量组大鼠IL-1β 表达均显著降低（P＜0.05）。如图6c 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠IL-6 表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，FGF-21高、中剂量组大鼠IL-6表达显著降低（P＜0.05），FGF-21 低剂量组大鼠无显著变化。结果表明FGF-21可有效降低阿霉素诱导大鼠心脏中TNF-α、IL-1β和IL-6表达，呈剂量依赖性降低大鼠心脏IL-6表达。

2.7 FGF-21对阿霉素诱导心肌损伤大鼠胸、腹腔积液中TNF-α、IL-1β和IL-6表达的影响

如图7a 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠积液中TNF-α 表达量极显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，FGF-21 高、中剂量组大鼠积液中TNF-α 表达量极显著降低（P＜0.01），FGF-21 低剂量组大鼠TNF-α 表达量显著降低（P＜0.05）。如图7b 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠积液中IL-1β 表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，FGF-21 高、中、低剂量组大鼠积液中IL-1β 表达量均显著降低（P＜0.05）。如图7c 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠积液中IL-6 表达量极显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，FGF-21 高、低剂量组大鼠积液中IL-6 表达量显著降低（P＜0.05）。结果表明FGF-21可呈剂量依赖性降低阿霉素诱导大鼠胸、腹腔积液中TNF-α、IL-1β和IL-6表达量。

2.8 FGF-21对阿霉素诱导心肌损伤大鼠炎症蛋白和凋亡蛋白表达的影响

如图8所示，与正常对照组相比，模型组大鼠bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-8、stat3和P-NF-κB 表达均显著增加（P＜0.05），P-stat3 表达显著降低（P＜0.05），bcl-2 表达无显著差异；与模型组相比，FGF-21 高剂量组大鼠bax、cleaved caspase-3、stat3 和P-NF-κB 表达显著降低（P＜0.05），P-stat3表达显著增加（P＜0.05），cleaved-caspase-8 无显著变化，FGF-21 中剂量组大鼠bax、cleaved caspase-3、stat3和P-NF-κB表达显著降低（P＜0.05）， P- stat3 表 达 显 著 增 加（P＜0.05），cleaved-caspase-8 无显著变化，FGF-21 低剂量组大 鼠P- NF- κB 表达 显 著降 低（P＜0.05）， bax、cleaved-caspase-3、 cleaved-caspase-8、stat3和Pstat3无显著变化。结果表明FGF-21可呈剂量依赖性降低bax、cleaved caspase-3 和P-NF-κB 表达，增加P-stat3 表达，激活阿霉素诱导大鼠心肌损伤模型中STAT3 通路，抑制心肌细胞凋亡，同时抑制NF-κB信号通路，缓解心肌细胞炎症反应。

2.9 FGF-21对阿霉素诱导大鼠心肌损伤的影响

如图9 所示，与正常对照组相比，模型组大鼠左心室壁及心腔面有多处胶原纤维沉积，呈斑块状，局部心肌细胞缺失，周围心肌细胞空泡变，并见少量炎症细胞浸润和组织细胞增生，左心室壁多处见蓝染胶原纤维沉积；与模型组相比， FGF-21高剂量组大鼠左心壁肌间血管周围纤维组织增多，周围心肌细胞空泡变，有极少量炎症细胞浸润，血管周围蓝染区扩大；FGF-21中剂量组大鼠左心壁肌间见纤细网状分布的成纤维细胞，周围心肌细胞空泡变，有极少量炎症细胞浸润，蓝染纤维呈纤细网状；FGF-21低剂量组大鼠局部左心室壁极薄，心腔面和心包膜面大量纤维组织增生，存留中间少量心肌纤维。周围心肌细胞变性，并见少量炎症细胞浸润，心腔面和心包膜面为蓝染胶原纤维。结果表明FGF-21有效缓解阿霉素诱导的大鼠心肌纤维化损伤。

2.1 0 FGF-21 对阿霉素诱导H9C2 细胞炎症蛋白和凋亡蛋白表达的影响

结果如图10 所示。

由图10 可知，与正常对照组相比，模型组细胞bax表达水平极显著增加（P＜0.01），cleaved-caspase-3、cleaved-caspase- 8、NF-κB、stat3 和PNF-κB 表达水平显著增加（P＜0.05），P-stat3 表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，FGF-21高剂量组细胞bax、cleaved-caspase-3、cleavedcaspase-8、NF-κB、stat3 和P-NF-κB 表达水平显著降低（P＜0.05），P-stat3 表达水平显著增加（P＜0.05），FGF-21 中剂量组细胞bax、cleaved-caspase-3、stat3、NF-κB 和P-NF-κB 表达水平显著降低（P＜0.05），P-stat3和cleaved-caspase-8表达水平无显著差异，FGF-21 低剂量组细胞bax、stat3和P-NF-κB 表达显著降低（P＜0.05）, cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-8、NF-κB和P-stat3无显著变化。结果表明FGF-21 可激活H9C2 心肌细胞STAT3 通路，增加心肌细胞P-stat3 表达，下调bax、 cleaved- caspase- 3 和cleaved- caspase- 8 表达，抑制心肌细胞凋亡，同时抑制P-NF-κB 表达，缓解心肌细胞炎症反应。

3 讨论与结论

DOX 诱导心脏毒性发病机制涉及复杂的过程，涉及激活各种下游的促炎、促氧化和促凋亡过程[18]，严重可诱导心力衰竭，继而发展成心脏疾病[19]。近年来研究者发现DOX 可增加IL-6 等炎症因子mRNA 表达，上调炎症因子蛋白表达，诱发H9C2心肌细胞炎症，除此之外激活NF-κB信号通路也可诱发心肌炎症[20]。同时DOX可通过TGF-β1/Smad3通路促进凋亡蛋白表达，诱导心肌细胞发生凋亡作用[21-22]。Zhang 等报道FGF-21 对抑制炎症、抗氧化应激方面有较好效果[5]，通过激活Nrf2 抑制NF-κB 信号通路抑制巨噬细胞介导的炎症反应，也可通过Nrf2通路保护小鼠肝脏[23]。在凋亡方面，FGF-21 也发挥重要作用，有氧运动可上调心梗大鼠内源性FGF-21 表达抑制H9C2 心肌细胞凋亡[24]，但在阿霉素诱导的心肌凋亡大鼠模型中，尚无FGF-21 与NF-κB 和STAT3 信号通路关系的报道。因此本研究利用DOX 诱导心肌损伤大鼠模型探究FGF-21 对NF-κB 和STAT3 信号通路的作用，并在细胞水平上开展相同通路探究，阐明FGF-21经NF-κB 和STAT3 信号通路缓解DOX 诱导的大鼠心肌损伤的作用。

本研究表明，在阿霉素诱导的大鼠心肌损伤模型中，FGF-21 可减少胸、腹腔积液和积液中炎症因子表达，通过抑制NF-κB 信号通路抑制大鼠心肌炎症反应，激活STAT3 信号通路抑制大鼠心肌细胞凋亡作用，预防心肌纤维化发生。本研究不仅为FGF-21临床应用、阿霉素毒副作用预防与机制研究提供理论基础，也为其他药物性等原因心肌炎症反应和凋亡作用的预防与机制研究提供参考。但本研究发现DOX 诱导的心肌损伤大鼠和细胞模型中，bcl-2 表达无明显变化，与兰蕊等研究指出DOX 诱导心肌病中bcl-2 表达下调变化不同[17]，同时心肌损伤大鼠模型出现胸、腹腔积液原因尚未明确，此为本实验室未来研究主要方向。