舒眠胶囊的镇静催眠作用及其机制

梁凡凡，张 鑫，蒋茜茜，张凯娜，AL-MAAMARI Ahmed，王红英，赵正杭

(西安交通大学医学部基础医学院药理学系，陕西西安 710061)

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性SPF级昆明小鼠150只，体质量18～22 g；雄性SPF级SD大鼠60只，体质量160～200 g，由西安交通大学实验动物中心提供，生产许可证：SYXK(陕)2016-003。饲养环境温度为23～25 ℃，自由饮水和进食，动物适应性喂养1周后开始实验。

1.2 主要药品、试剂及仪器舒眠胶囊(贵州大隆有限责任公司，批号：20181122)； PCPA(源叶生物，CAS：7424-00-2)；地西泮片(山东信谊制药有限公司，批号：181004)；戊巴比妥钠(索莱宝，批号：922L035)。

GABA酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20190715)；谷氨酸测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：20190619)；5-HT1AR抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号：AG08167243)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号：060519190611)。

ZZ-6型小鼠自主活动记录仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)；OFT-100开场活动实验系统(四川成都泰盟科技有限公司)；Multiskan FC型全波段酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；Bio-Rad电泳仪(美国Bio-Rad公司)；VILBER Fusion FX5凝胶成像仪(法国VILBER LOURMAT公司)。

1.3 动物分组及给药小鼠实验：雄性昆明小鼠随机分成5组，即空白对照组、阳性药地西泮组[2 mg/(kg·d)]、舒眠胶囊高、中、低剂量组[6.4、3.2、1.6 g/(kg·d)]，每组10只。按0.2 mL/10 g容量灌胃给药，空白对照组给予等体积生理盐水，连续灌胃14 d。

1.4 舒眠胶囊对小鼠自主活动的影响各组小鼠末次给药60 min后，将各组小鼠放入多功能小鼠自主活动记录仪，适应2 min后，观察记录5 min内小鼠自主活动次数及站立次数。

1.5 舒眠胶囊对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠的影响各组小鼠末次灌胃60 min后，各组小鼠腹腔注射32 mg/kg戊巴比妥钠，以翻正反射消失1 min以上为入睡标准，记录30 min内各组入睡小鼠数。

1.6 舒眠胶囊对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠的影响各组小鼠末次灌胃60 min后，各组小鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠，以翻正反射消失1 min以上为入睡标准，记录各组小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间。

1.7 小鼠脑组织中GABA及Glu含量测定各组小鼠末次灌胃60 min后，脱颈椎处死小鼠后迅速剥取全脑，分离皮质及海马组织，在冰冷生理盐水中漂洗干净，称质量，并制备100 g/L的脑组织匀浆，4 ℃离心，取上清液于EP管并保存在-80 ℃冰箱中待测。采用 ELISA法按照试剂盒说明书测定脑组织中GABA含量，采用比色法按照试剂盒说明书测定海马及皮质中Glu的含量。

1.8 大鼠一般状况及体质量变化情况记录各组大鼠在实验期间活动量、皮毛、精神状态、对外界刺激的反应、粪便变化等一般情况的变化，并比较各组大鼠体质量变化情况。

1.9 旷场实验各组大鼠末次灌胃30 min后，在安静、光强度温和条件下进行旷场实验，即底面和侧壁为黑色的大鼠旷场箱，规格为625 mm(L)×740 mm(W)×510 mm(H)，正上方安置红外摄像机，全程记录大鼠在空旷场地的活动情况。测试时，将大鼠置于箱底中心，观察5 min内运动总路程及站立次数(两前爪腾空或攀附箱壁)。

1.10 标本采集与储存各组大鼠进行旷场实验后，脱颈椎处死大鼠，在枕骨大孔处快速剪断延髓，去除颅骨，完全暴露、分离脑组织，在冰冷生理盐水中洗净，迅速分离各组大鼠(n=4～6)海马组织，立即放入液氮冻存，随后放入-80 ℃冰箱保存。另外，每组其余大鼠各3只取完整大脑半球，放入40 g/L多聚甲醛固定，取海马段，制作常规石蜡切片。

1.11 蛋白免疫印迹法检测大鼠海马5-HT1AR蛋白的表达取大鼠海马组织约50 mg于1.5 mL EP管中，加入(RIPA裂解液∶PMSF=9∶1)的混合溶液450 μL，超声裂解完全后，4 ℃离心取上清，进行蛋白含量测定、蛋白变性及分装。15 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳后，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，加入一抗(兔抗5-HT1AR，1∶1 000)，内参为GAPDH(兔抗GAPDH，1∶5 000)。4 ℃摇床过夜孵育后，TBST缓冲溶液清洗3次×5 min，加入有辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育2 h，TBST缓冲溶液清洗3次×5 min，暗室进行ECL发光液显色曝光，照片用Image J软件进行条带分析。

1.12 免疫组化法检测大鼠海马5-HT1AR蛋白的表达将大鼠脑组织石蜡切片，经抗原修复，内源性过氧化物酶封闭，加一抗工作液(兔抗5-HT1AR，1∶200)，置湿盒中4 ℃过夜孵育；PBS洗3次，滴加二抗(HRP标记)室温孵育60 min。PBS洗3次，DAB显色，苏木素复染2 min，脱水透明后封片拍照。每张切片随机选取3个高倍视野观察，运用 Image pro-plus图像分析软件，测量阳性细胞的平均吸光度值。

2 结 果

2.1 舒眠胶囊对小鼠自主活动的影响阳性药地西泮组小鼠自主活动及站立次数较空白对照组显著减少(P<0.01)；而舒眠胶囊高、中、低剂量各组小鼠自主活动及站立的次数也均明显减少(P<0.01)，但与地西泮组比较，对自主活动次数的影响差异无统计学意义(P>0.05)，而对站立次数的降低作用较地西泮组较弱(P<0.01)；舒眠胶囊各剂量组间对自主活动次数的影响无统计学差异，高剂量组对站立次数的降低作用明显强于中、小剂量组(P<0.05，表1)。说明舒眠胶囊具有明显抑制小鼠自发活动的作用。

2.2 舒眠胶囊对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠的影响舒眠胶囊对阈下剂量戊巴比妥钠(32 mg/kg)诱导小鼠睡眠发生率采用卡方检验进行分析，χ2值为22.974(P<0.001)，阈下剂量戊巴比妥钠致空白对照组1/10(10.0%)小鼠入睡，地西泮组有10/10(100.0%)小鼠入睡(P<0.01)；舒眠胶囊高剂量组有7/10(70.0%)小鼠入睡，采用Fisher精确检验，与空白对照组比较，高剂量组作用有显著增强(P<0.05)(根据Boferronni调整α水平后P>0.01)；中、低剂量组分别有4/10(40.0%)和2/10(20.0%)的小鼠入睡率，与空白对照组无明显差异(P>0.05)。

表1 舒眠胶囊对小鼠活动及站立次数的影响Tab.1 Effect of Shumian Capsule on activity times and standing times of mice n=10)

2.3 舒眠胶囊对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠的影响与空白对照组比较，地西泮组能缩短阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠潜伏期，明显延长睡眠持续时间(P<0.01)；舒眠胶囊各剂量组对小鼠睡眠潜伏期缩短有一定作用，但差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量组较空白对照组可明显延长睡眠时间(P<0.01)，中、低剂量组有一定延长睡眠的作用，但差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量组对睡眠持续时间的延长作用较地西泮组较弱(P<0.01，表2)。说明舒眠胶囊可延长小鼠睡眠持续时间。

表2 舒眠胶囊对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠潜伏期和持续时间的影响Tab.2 Effect of Shumian Capsule on sleep latency and sleeping time in mice treated with a threshold dose of sodium pentobarbital min，n=10)

2.4 舒眠胶囊对小鼠脑组织GABA及Glu含量的影响与空白对照组比较，地西泮组小鼠脑组织中 GABA水平显著升高(P<0.01)，舒眠胶囊剂量依赖性地升高小鼠脑组织中GABA水平(P<0.01，P<0.05)，而高剂量组较低剂量组升高小鼠脑组织中 GABA水平作用更显著(P<0.05)；与地西泮组比较，舒眠胶囊各剂量组升高GABA水平的作用无明显差异(P>0.05，表3)。表明舒眠胶囊可提高小鼠脑组织GABA水平。

与空白对照组比较，地西泮组小鼠海马及皮质中Glu水平均明显降低(P<0.05或P<0.01)；舒眠胶囊高、中剂量组均可明显降低小鼠海马Glu水平(P<0.01，P<0.05)，高剂量组也明显降低皮质Glu水平(P<0.05)，中剂量组皮质Glu水平有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。与地西泮组比较，舒眠胶囊高剂量组降低皮质Glu水平的作用较弱(P<0.05)。表明舒眠胶囊可有效降低小鼠脑组织中Glu水平。

表3 舒眠胶囊对小鼠脑组织中 GABA及Glu含量的影响Tab.3 Effects of Shumian Capsule on GABA and Glu levels in brain tissue of mice n=10)

2.5 舒眠胶囊对PCPA失眠模型大鼠一般状况的影响空白对照组大鼠精神状态良好，昼夜活动节律正常，毛发有光泽，对外界刺激反应迅速，粪便颜色、形状正常，有一定硬度；模型组大鼠昼夜活动均增加，节律消失，毛发泛黄、变硬、粗糙无光泽，掉毛现象严重，对外界刺激异常敏感，易受惊吓，攻击性增高，粪便颜色为白灰色，且松软不成型；舒眠胶囊高、中、低剂量组与模型组比较，精神状态得到改善，夜间活动频繁，白天较少，活动节律恢复，毛发相对润泽，掉毛现象有所改善，反应较灵敏，攻击性稍有减弱，粪便颜色恢复正常且成型。说明舒眠胶囊可在一定程度上改善失眠大鼠的一般精神状态。

2.6 舒眠胶囊对PCPA失眠模型大鼠体质量的影响与空白对照组比较，腹腔注射PCPA后，大鼠体质量增加量显著降低(P<0.01)，表明失眠可造成大鼠体质量增加减缓。与模型组比较，在经地西泮及舒眠胶囊各剂量治疗后，大鼠体质量增加量均明显升高(P<0.01)；与地西泮组相比，舒眠胶囊高、中剂量组体质量增加量已无明显差异(P>0.05)，但低剂量组仍有一定差异(P<0.05)。舒眠胶囊各剂量组间体质量增量并无明显差异(P>0.05，表4)。表明舒眠胶囊有助于改善失眠大鼠体质量增长。

表4 舒眠胶囊对PCPA 失眠模型大鼠体质量的影响Tab.4 Effect of Shumian Capsule on rat weight of PCPA insomnia model n=10)

2.7 舒眠胶囊对PCPA失眠模型大鼠自主活动的影响与空白对照组比较，模型组动物平均运动距离明显增长(P<0.01)，其余各组平均运动距离有减少趋势(P>0.05)；与模型组相比，地西泮组和舒眠胶囊高、中、低各剂量组动物平均运动距离均明显减少(P<0.01)；舒眠胶囊各剂量组动物平均运动距离与地西泮组差异无统计学意义(P>0.05)，且舒眠胶囊各剂量组间平均运动距离无明显差异；另外，模型组、地西泮组及舒眠胶囊各剂量组与空白对照组比较，平均站立次数的差异均无统计学意义(P>0.05，表5)。表明舒眠胶囊对PCPA失眠模型大鼠自主活动有一定的抑制作用。

2.8 舒眠胶囊对失眠模型大鼠海马CA1区5-HT1AR蛋白表达的影响Western blotting结果显示，模型组大鼠海马CA1区5-HT1AR蛋白表达较空白对照组明显减少(P<0.01，n=6)；地西泮组和舒眠胶囊高、中剂量组5-HT1AR蛋白表达较模型组明显增加(P<0.05或P<0.01，n=4)；舒眠胶囊高、中剂量组的组间比较及与地西泮组均无明显差异(P>0.05，n=4，图1A)。

表5 舒眠胶囊对PCPA失眠模型大鼠运动距离及站立次数的影响Tab.5 Effect of Shumian Capsule on movement distance and standing times of PCPA insomnia rats n=10)

免疫组化结果显示：模型组5-HT1AR蛋白在大鼠海马CA1区表达较空白对照组明显减少(P<0.01，n=3)；地西泮组和舒眠胶囊高、中剂量组动物海马CA1区5-HT1AR蛋白表达较模型组明显增加(P<0.05或P<0.01，n=3)；舒眠胶囊高、中剂量组的组间5-HT1AR蛋白表达及与地西泮组相比均无明显差异(P>0.05，n=3，图1B)。表明舒眠胶囊可明显改善PCPA型失眠模型大鼠海马CA1区5-HT1AR蛋白的表达。

3 讨 论

临床证据表明舒眠胶囊治疗失眠症的效果良好，如在比较舒眠胶囊和奥沙西泮片治疗失眠的疗效中发现，口服用药1月后，舒眠胶囊组在41例患者中睡眠治疗总有效率达82.9%，奥沙西泮片组在42例患者中治疗失眠的总有效率达78.6%[4]。舒眠胶囊可有效减轻患者失眠症状，提高患者生活质量，但其药理机制尚未阐明。

舒眠胶囊由酸枣仁、柴胡、白芍、合欢花、合欢皮、僵蚕、蝉蜕、灯心草组成，其中酸枣仁和柴胡疏肝解郁和安神的效果较好，白芍、合欢花、僵蚕和蝉蜕可解郁，灯心草可静心安神[5]。酸枣仁为鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子，其多擅长于安神，为养心安神之要药。酸枣仁总黄酮和酸枣仁总皂苷是酸枣仁发挥镇静催眠的主要有效成分。有研究将酸枣仁皂苷提取物灌胃小鼠，发现皂苷提取物可增加阈下戊巴比妥钠小鼠的入睡率，缩短睡眠潜伏期，延长睡眠时间[6]。

大量研究表明，酸枣仁活性成分可通过调节多种神经递质如多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)、GABA、Glu等发挥镇静催眠作用[7]。研究证实，柴胡及柴胡总皂苷具有镇静作用，柴胡皂苷C可明显延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间[8]。

动物的自主活动反映其中枢神经系统的兴奋状态，大脑皮层兴奋性与动物自主活动次数呈正相关。本研究发现舒眠胶囊各剂量组均能明显减少小鼠自主活动，说明舒眠胶囊具有镇静作用。戊巴比妥钠具有中枢抑制作用，小剂量可镇静催眠。戊巴比妥钠阈上阈下剂量实验是通过观察受试物是否能够延长戊巴比妥钠的睡眠时间，判断其是否与戊巴比妥钠有协同催眠作用。本实验发现舒眠胶囊能增加阈下剂量戊巴比妥钠致入睡小鼠数，延长小鼠阈上剂量戊巴比妥钠诱导睡眠时间，延长睡眠时间，提示舒眠胶囊具有明显催眠作用。

GABA是中枢重要的抑制性递质，通过GABA能通路包括GABA受体、GABA 的合成代谢及转运或Glu/GABA稳态发挥对中枢兴奋性神经元的抑制作用，产生镇静催眠作用[9]。Glu是中枢主要的兴奋性递质，能激活海马CA1区和齿状回的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体发挥作用[10]。高家荣等[11]研究发现，失眠模型大鼠 GABA含量降低，Glu含量升高，Glu/GABA显著升高，而酸枣仁-五味子药对醇水双提物可升高大鼠下丘脑GABA含量，降低Glu含量及Glu/GABA。同样，百合地黄汤可显著降低失眠模型大鼠Glu/GABA比例的升高，改善大鼠失眠状态[12]。本研究结果显示，舒眠胶囊能明显升高小鼠脑组织中GABA水平，降低海马及皮质组织中Glu水平，说明舒眠胶囊可通过调节中枢神经递质Glu和GABA，从而治疗失眠症。

在睡眠与觉醒调节中，中枢神经系统中单胺类递质发挥着重要作用，5-HT是重要的单胺类神经递质，主要分布在低位脑干近中线区的中缝核内[13]。5-HT1受体通过降低环磷酸腺苷浓度而发挥中枢抑制性作用[14]。研究表明5-HT可有效改善失眠症状，因此，制备失眠动物模型可通过注射能够减少5-HT合成的PCPA，以产生失眠症状[15-16]。新近有研究通过代谢组学技术发现酸枣仁可使PCPA诱导的失眠大鼠血清色氨酸含量升高，而色氨酸在体内酶的催化下氧化脱核转变为5-HT，继而提高中枢5-HT 水平，改善失眠症状[17]。另外在慢性不可预期温和应激(CUMS)失眠小鼠模型，发现酸枣仁合欢方皂苷灌胃小鼠阈剂量戊巴比妥钠所致睡眠时间明显延长，小鼠海马及大脑皮层5-HT含量显著升高，对CUMS失眠小鼠有镇静催眠作用[18]。研究报道，酸枣仁提取物可以增加大鼠脑内5-HT1AR蛋白的表达[19]。本研究采用腹腔注射PCPA来建立大鼠失眠模型，结果显示，模型组5-HT1AR蛋白表达较空白对照组减少，而舒眠胶囊较模型组可显著升高5-HT1AR蛋白的表达，这可能是舒眠胶囊改善失眠的另一机制。本研究为舒眠胶囊镇静催眠的临床应用提供了实验依据，该复方组分较多，药理作用机制复杂，因此可能具备多靶点、多途径调节的治疗特点，但其详细作用机制还有待进一步研究。