高脂饮食对ApoE敲除小鼠炎症反应及外周血单核细胞斑块内迁徙的影响

马 宁，魏琳琳，刁腾月，赵 璇,2，王晓梅,3，李 可

(1.西安交通大学第二附属医院科研中心实验室，陕西西安 710004；2. 商洛市中心医院检验科，陕西商洛 726000；3. 汉中市洋县人民医院检验科，陕西汉中 723300)

动脉粥样硬化是一种威胁中老年人健康的最常见的心血管疾病，是引起如心脑梗死、中风、主动脉瘤等各种急慢性心血管意外的首要病因[1]，由其引发的心脑血管病死亡是全球主要死亡原因之一。目前普遍认为动脉粥样硬化是一种血管壁的慢性炎症疾病[2]。动脉粥样硬化的炎症发病机制是一个多步骤过程[3]，其中单核/巨噬细胞发挥着重要作用[4-6]。血液单核细胞在趋化因子作用下黏附于损伤的血管内皮细胞并侵入内皮下聚集分化为巨噬细胞，吞噬脂蛋白分化为泡沫样细胞并堆积形成脂质条纹乃至脂质斑块[7-9]。本研究对比正常饮食对照及高脂饮食(8周和16周)诱导动脉粥样硬化小鼠组织及全身炎症状态，利用红色荧光染料PKH26标记纯化的外周血单核细胞，通过尾静脉注射入小鼠体内，探讨炎症微环境对单核细胞向动脉粥样硬化斑块迁徙影响，为动态观察动脉粥样硬化过程中炎症微环境状态变化、炎症细胞向斑块内迁徙提供了有效的研究方法和形态学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料油红O染料(AMRESCO)，CCL2 ELISA试剂盒(R&D Systems)，TNF-α ELISA试剂盒(BD Biosciences)，流式抗体CD45(30-F11, APC)，CD11b(M1/70, FITC)，Ly6G(1A8, PE)，Ly6C(HK1.4, PE/Cy7)(Biolegend)，PKH26红色荧光细胞标记试剂盒(Sigma-Aldrich)、Trizol、核酸染料SYBR Green、DAPI(Thermo Fisher Scientific)，反转录酶M-MLV(Promega)。流式细胞仪(BD Calibur, BD AriaⅡ)，实时定量PCR仪(ABI StepOne)，徕卡激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS SP8)，徕卡冰冻切片机(LeicaCM1900)，酶标仪(Bio-tek)。

1.2 实验动物及模型建立SPF级C57BL/6 ApoE敲除小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京) 2016-0006]，于西安交通大学医学部实验动物中心[SYXK (陕) 2015-0002]SPF级环境繁育饲养，体质量(20.0±2.0)g。随机将36只雄鼠分为3组，各12只：正常饮食6周龄；高脂饮食(21%脂肪，0.15%胆固醇)8周(从6周龄开始)；高脂饮食16周小鼠，用于主动脉病理检查及炎症检测[10-12]。25只小鼠用于单核细胞回输实验：其中高脂饮食16周小鼠(15只)随机分为3组，各5只，用于不同量单核细胞回输；随机将另外10只小鼠分为2组(高脂饮食8周或16周)，各5只，用于相同量单核细胞不同周龄鼠回输实验。所有动物实验经过西安交通大学动物实验伦理委员会批准，批件号：XJTULAC2020-16。

1.3 实验方法

1.3.1主动脉及主动脉根部病理检查 主动脉根部40 g/L多聚甲醛固定2 h后，200 g/L蔗糖过夜，OCT包埋，冰冻切片机5 μm连续切片。主动脉及主动脉根部切片进行油红O染色，图像分析软件(Image Pro Plus, IPP)计算斑块面积[13]。

1.3.2主动脉炎性因子及细胞mRNA表达量检测 采用Trizol法提取主动脉RNA，用M-MLV反转录合成cDNA。SYBR Green染料行实时定量PCR，采用相对定量法(2-△△CT)计算mRNA相对表达量，△△CT=(CT目的基因-CTβ-actin)实验组-(CT目的基因-CTβ-actin)对照组。以正常对照小鼠主动脉炎性因子或细胞表达水平(设为1)为对照。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，各引物序列见表1。

表1 各引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3.3ELISA检测血浆炎性因子表达量 利用CCL2及TNF-α ELISA试剂盒，酶标仪450 nm读取A值，根据标准品标准曲线计算待测样本浓度。

1.3.4流式检测外周血炎性细胞 肝素抗凝外周血，冰上裂解红细胞后，重悬入100 μL PBS，加Fc受体阻断抗体，冰上孵育10 min。随后加入大鼠抗小鼠APC-CD45、FITC-CD11b、PE-Ly6G、PEcy7-Ly6C及相应同型对照抗体，冰上孵育20 min。PBS洗2遍，重悬入300 μL PBS上机检测。FlowJo 7.6软件分析流式细胞术结果。

1.3.5外周血单核细胞分选、标记、回输及检测 6～8周龄ApoE敲除雄鼠，收抗凝外周血，裂解红细胞，封闭，利用流式抗体标记细胞，流式分选得到CD45+CD11b+ly6G-单核细胞，利用PKH26细胞染料标记红色荧光[14]。将不同浓度的标记细胞，尾静脉注射入动脉粥样硬化模型小鼠体内。24 h后收取主动脉根部，OCT包埋，5 μm冰冻切片，DAPI染色后[15]，共聚焦显微镜计数PKH26红色荧光标记细胞数量。

1.4 统计学分析采用SPSS 20.0及Graph Pad Prism 7.0处理数据、作图。计量资料用均数±标准差表示，两组之间比较采用两独立样本t检验或Mann-Whitney检验(不符合正态分布或方差不齐)；单一变量多组间比较用One-Way ANOVA分析，组间两两比较采用LSD法进行分析。P<0.05视为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高脂饮食8周和16周ApoE敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的对比本研究利用高脂饮食诱导动脉粥样硬化模型。为比较高脂饮食8周和16周ApoE敲除小鼠动脉粥样硬化斑块，整条主动脉和主动脉根部切片进行脂质油红O染色，以正常饮食6周龄小鼠作为阴性对照。高脂饮食16周小鼠较高脂饮食8周小鼠主动脉斑块明显增多(t=6.276，P<0.001，图1A、图1C)，主动脉根部斑块亦明显增多(Z=-2.882，P<0.01，图1B、图1D)。结果提示，高脂饮食时间延长，ApoE敲除小鼠动脉粥样硬化病变加重。

图1 高脂饮食8周和16周ApoE敲除小鼠动脉粥样硬化斑块的比较

2.2 高脂饮食8周和16周ApoE敲除小鼠组织炎症变化为检测小鼠主动脉组织局部炎症变化，利用实时定量PCR检测相关炎症/趋化因子及细胞含量。以正常饮食6周龄小鼠相应mRNA相对表达平均值为1，高脂饮食16周小鼠主动脉炎症/趋化因子CCL2(Z=-2.882,P<0.01)、TNF-α(Z=-2.722,P<0.01)、IL-1β(Z=-2.882,P<0.01)相对表达量均较高脂饮食8周小鼠明显升高，差异具有统计学意义(表2，图2A)。高脂饮食16周小鼠主动脉巨噬细胞相对表达量(9.86±0.74)明显高于高脂饮食8周小鼠(4.93±0.38)，差异具有统计学意义(t=5.914，P<0.001，图2B)。提示高脂饮食16周小鼠主动脉组织巨噬细胞增多，局部炎性反应加重。

表2 高脂饮食小鼠主动脉相关促炎因子mRNA水平Tab.2 mRNA levels of proinflammatory cytokines on high-fat diet(n=6)

2.3 高脂饮食8周和16周ApoE敲除小鼠全身炎症变化ELISA检测血浆炎症/趋化因子结果显示：随高脂饮食时间延长，血浆炎症/趋化因子CCL2、TNF-α含量显著升高(P<0.001，图3A)。流式分析外周血免疫细胞测定，细胞分群策略见图3B。随高脂饮食时间延长，小鼠外周血粒细胞、单核/巨噬细胞及炎性单核/巨噬细胞亚群逐渐增多(P<0.05或P<0.01，图3C)，单核/巨噬细胞受体CCR2平均荧光强度逐渐增高(P<0.01，图3D)。提示高脂饮食16周小鼠全身炎性反应加重。

图2 高脂饮食16周小鼠组织炎症反应加重

图3 高脂饮食16周小鼠全身炎症反应加重

2.4 PKH26标记单核细胞主动脉根部迁徙比较PKH26标记单核细胞分为3组，2×105/100 μL、5×105/100 μL、1×106/100 μL尾静脉输入高脂饮食16周ApoE敲除小鼠体内。24 h后，各组主动脉根部斑块内红色荧光阳性单核细胞数量分别为：6.40±1.36、16.80±2.27和34.20±4.53，组间比较具有统计学差异(F=21.49，P<0.001，图4A、图4B)。2×105/100 μL组即可检测到迁徙细胞，随回输细胞数量增多，斑块内迁徙细胞增多。为观察炎症微环境对单核细胞向斑块内迁徙影响，2×105/100 μL标记单核细胞尾静脉注射入高脂饮食8周和16周ApoE敲除小鼠。结果发现，高脂饮食16周小鼠主动脉根部斑块中迁徙细胞个数(7.20±1.02)明显多于高脂饮食8周小鼠(1.80±0.37)，差异具有统计学意义(t=4.971,P<0.01，图4C、图4D)。

图4 尾静脉注射PKH26标记单核细胞主动脉根部迁徙的比较

3 讨 论

尽管在治疗方面取得了重大进展，但动脉粥样硬化的临床后遗症、心脏病发作和中风仍是目前的主要死亡原因。ROSS课题组[16]在1986年首次明确提出动脉粥样硬化是一种炎症性疾病，是对损伤的一种过度防御反应。目前普遍认为，动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病[2,17]。动脉粥样硬化的发生发展涉及到动脉内膜中多种细胞的活化[18]，从而导致局部炎症反应。

巨噬细胞是AS斑块内的重要炎症细胞，对微环境炎症状态发挥重要影响作用，参与动脉粥样硬化疾病进展各个阶段[19-20]。本研究利用流式分选技术，分选外周血单核细胞，体外标记红色荧光染料PKH26，通过细胞回输, 原位展现外周血单核细胞进入斑块并进行定量分析。实验发现，随着回输细胞增多，斑块内迁徙细胞增多。因小鼠循环血量少，每只小鼠大约仅能获得1 mL全血，获取外周血单核细胞总量低，2×105可作为首选尾静脉注射细胞量，此细胞量较为经济。另外，实验发现，随高脂饮食时间延长，ApoE敲除小鼠动脉粥样硬化病变加重，组织及全身炎性反应加重，其炎症微环境有助于外周血单核细胞向动脉粥样硬化斑块内迁徙。

研究证实，PKH26可用于多种细胞染色，其不可逆地结合细胞膜脂质双层，假阳性率低。其毒性较小，只要标记浓度适当，基本不会对细胞生物学特征产生影响，并且可以在体内保留长达1年[14]。本研究在动脉粥样硬化小鼠模型中成功建立了PKH26标记单核细胞体内迁徙示踪模型。此方法可应用于其他免疫细胞或实质细胞体外分选及体内示踪，也可应用于不同标记或携带不同基因修饰的细胞治疗和作用研究。