香菇多糖对培养肝癌细胞索拉非尼耐药的逆转作用及机制

韩丽丽，吴 菲，黄蓝萱，张淑群

(西安交通大学第二附属医院肿瘤病院，陕西西安 710004)

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)近10年的发病率持续上升，目前位居全球第五大恶性肿瘤[1]。肝癌起病隐匿，发展迅速，缺乏有效治疗手段。索拉非尼(Sorafenib)作用于迅速加速性纤维肉瘤(rapidly accelerated fibrosarcoma, RAF)激酶、血管内皮生长因子受体22(vascular endothelial growth factor, VEGFR22)、VEGFR23、血小板源性生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR2β)及干细胞因子受体等多靶点，明显延长了晚期肝癌患者的生存时间，是目前临床上用于治疗晚期肝癌的一线药物[2]。然而，索拉非尼的耐药现象在临床上普遍存在，极大地限制了其应用[3]。引起索拉非尼耐药的机制目前仍不完全清楚。因此，进一步揭示索拉非尼发生耐药的可能机制，降低其耐药是肝癌治疗中亟待解决的问题。

香菇多糖(lentinan, LNT)是一种从香菇食用菌中提取、加工和纯化的香菇子实体细胞壁的结构多糖成分，可通过诱导肿瘤细胞凋亡和调节免疫发挥抗肿瘤作用[4-5]。LNT在一定程度上具有抑制肝癌细胞侵袭与增殖的作用，同时具有成分稳定、不良反应小的特点，在临床上广泛用于肝癌的辅助治疗。近年来，多项研究提示，LNT能够通过降低肿瘤细胞中多药耐药基因1(multi-drug resistance1 gene, MDR1)和多药耐药相关蛋白(multidrug resistance protein-1, MRP1)，部分逆转胆囊癌、肺癌等肿瘤的多药耐药[6-8]。然而，尚无文献报道LNT是否能够逆转肝癌细胞对索拉非尼的耐药。本研究通过体外实验揭示了LNT可能通过抑制缺氧诱导因子-1(hypoxia-induced factor, HIF-1α)及血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达来发挥逆转肝癌细胞株BEL-7402/S对索拉非尼耐药的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂人肝癌细胞株BEL-7402购自中国上海富衡细胞中心；索拉非尼购于北京索莱宝生物科技有限公司(纯度：99%)；胎牛血清购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基美国Thermo Fisher科技公司；胰蛋白酶购自Sigma公司；RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；Western blotting所用GAPDH、HIF-1α和VEGF的一抗购买于武汉三鹰生物技术有限公司，二抗购买于北京博奥森公司；LNT购于上海源叶生物科技有限公司(纯度>98%)，呈褐色粉末，易溶于50 g/L葡萄糖溶液。

1.2 细胞培养BEL-7402细胞培养在含150 mL/L胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃细胞培养箱中。1～3 d传代1次，1.25 g/L胰酶消化传代。

1.3 肝癌索拉非尼耐药细胞的建立采用浓度梯度递增法构建BEL-7402/S耐药细胞株，以浓度为0.5 μmol/L的索拉非尼作为起始浓度进行诱导，逐步进行浓度爬坡，每次爬坡浓度约提高1.5倍，每14 d爬坡1次，最终得到稳定的能耐受4 μmol/L索拉非尼的BEL-7402/S耐药细胞株。BEL-7402/S细胞株培养在含有0.2 μmol/L索拉非尼的培养液以维持其耐药性。实验前5～6 d，将BEL-7402/S细胞恢复至正常培养液中培养。

1.4 CCK-8法检测LNT和索拉非尼对肝癌细胞的增殖-毒性作用取对数生长期的BEL-7402或BEL-7402/S细胞接种于96孔板内，每孔加100 μL培养基，细胞密度为5×104/mL。待细胞融合到80%，以梯度稀释的方法分别加入由完全培养基配制的6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 mg/L LNT，空白对照组(细胞+培养液)，各组均设3个复孔。另设调零孔(培养液)。将96孔板置入37 ℃、50 mL/L CO2细胞培养箱48 h，弃去各孔内液体，每孔加入100 μL含10% CCK-8的培养液，置于培养箱内孵育4 h。用酶标仪测定各孔在450 nm波长下的吸光值(A)，利用公式细胞存活率(%)=(实验组平均A-空白对照平均A)/(对照组平均A-空白对照平均A)×100%，计算出LNT对两种细胞生存率的影响以及相应的IC50值。

检测索拉非尼对BEL-7402/S细胞的增殖-毒性作用与以上步骤相同，其作用浓度分别为3、6、12、24、48、96、192 μmol/L和15、30、60、120、240、480、960 μmol/L。

1.5 qRT-PCR法检测LNT对BEL-7402/S细胞HIF-1α及VEGF mRNA表达的影响接种BEL-7402/S细胞(密度为5×104/mL)至6孔板，每孔2 mL，实验组与对照组各设3个复孔。细胞融合至70%时，对照组加入索拉非尼药液(终质量浓度为117.797 μmol/L)，实验组中加入LNT(终质量浓度为16 mg/L)与索拉非尼药液(终质量浓度为117.797 μmol/L)。作用48 h，应用Trizol试剂分别提取各组肝癌细胞的总RNA，利用紫外分光光度计测试RNA纯度和浓度；然后应用反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)反转录总RNA为cDNA。qRT-PCR条件：25 ℃ 10 min；42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，重复40个周期。所有实验重复3次。引物购自TaKaRa公司，引物序列见表1。HIF-1α和VEGF相对表达情况采用2-△△Ct法对比GAPDH表达进行数据分析。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes for qRT-PCR analysis

1.6 Western blotting检测LNT对BEL-7402/S细胞HIF-1α及VEGF蛋白表达的影响细胞分组、培养、给药同步骤1.5。给药干预48 h，用RIPA缓冲液分别溶解各组细胞，BCA法检测蛋白质浓度。每孔加样25 g相应总蛋白质进行蛋白SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上。50 g/L脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗HIF-1α(1∶1 000)、VEGF(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000)置于4 ℃冰箱过夜。TPBS清洗膜后加入二抗，37 ℃摇床放置2 h。用DNR生物成像系统进行发光、测试、照相。

2 结 果

2.1 LNT对BEL-7402和BEL-7402/S细胞的增殖-毒性作用不同浓度的LNT分别处理BEL-7402细胞和BEL-7402/S细胞48 h，两种细胞增殖较对照组均不同程度减弱，BEL-7402细胞和BEL-7402/S细胞增殖的减弱程度无明显差异。随后，应用Probit回归分析在置信限度中估算出LNT对BEL-7402和BEL-7402/S的IC50值分别为129.912 mg/L和195.223 mg/L(图1)。

图1 LNT对BEL-7402和BEL-7402/S细胞的增殖-毒性作用

2.2 BEL-7402/S细胞对索拉非尼的耐药性不同浓度的索拉非尼分别处理BEL-7402细胞和BEL-7402/S细胞48 h，应用Probit回归分析估算出索拉非尼对BEL-7402和BEL-7402/S的IC50值。索拉非尼对BEL-7402和BEL-7402/S的IC50值分别为12.812 μmol/L(图2A)及117.797 μmol/L(图2B)。根据耐药指数(RI)=IC50(耐药细胞)/IC50(亲本细胞)计算得出BEL-7402/S细胞对索拉非尼的RI为9.19。

图2 索拉非尼对BEL-7402(A)和BEL-7402/S(B)细胞的增殖-毒性作用

2.3 LNT逆转BEL-7402/S细胞对索拉非尼的耐药作用1、2、4、8、16、32 mg/L LNT分别联合117.797 μmol/L索拉非尼处理BEL-7402/S细胞48 h，加入1、2、4、8 mg/L LNT联合索拉非尼与单用索拉非尼的BEL-7402/S细胞增殖能力无明显差异。加入16、32 mg/L LNT联合索拉非尼的BEL-7402/S细胞增殖能力较单用索拉非尼明显降低(图3A)。16 mg/L的LNT即可以增加BEL-7402/S细胞对索拉非尼的敏感性，提高索拉非尼对BEL-7402/S细胞的抑制作用，降低IC50值，IC50值从117.797 μmol/L降至57.142 μmol/L(图3B)。

因此，本实验确定16 mg/L的LNT为逆转作用浓度。根据相对逆转率(relative reverse rate, RRR)=[IC50(耐药株单用化疗药)-IC50(耐药株化疗药+逆转剂)]/[IC50(耐药株单用化疗药)-IC50(亲本株单用化疗药)]，RRR≥1代表完全逆转，RRR<1代表部分逆转，LNTRRR为0.58。

图3 LNT逆转BEL-7402/S细胞对索拉非尼的耐药作用

2.4 LNT对BEL-7402/S细胞HIF-1α及VEGF mRNA表达的影响RT-qPCR检测16 mg/L LNT对BEL-7402/S细胞中HIF-1α及VEGF mRNA表达的影响，结果提示，与对照组相比，LNT可以下调BEL-7402/S细胞HIF-1α及VEGF mRNA的表达(P<0.05，图4)。

图4 LNT对BEL-7402/S细胞HIF-1α及VEGF mRNA表达的影响

2.5 LNT对BEL-7402/S细胞HIF-1α及VEGF蛋白表达的影响Western blotting结果显示，与对照组相比，LNT可下调 BEL-7402/S细胞HIF-1α及VEGF蛋白表达(P<0.05，图5)。这提示LNT通过抑制BEL-7402/S细胞中HIF-1α及VEGF表达，实现部分逆转BEL-7402/S细胞对索拉非尼的耐药。

图5 LNT对BEL-7402/S细胞HIF-1α及VEGF 蛋白表达的影响

3 讨 论

LNT是从优质香菇子实体中提取香菇的主要有效活性成分，具有β-(1-3)-D-葡聚糖，呈梳状结构。临床与药理研究表明，LNT具有抗肿瘤和调节免疫功能等作用[9-10]，临床上广泛用于实体恶性肿瘤的辅助治疗。

针对LNT抗肿瘤机制的多项研究证实，其可通过抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡、自噬，抑制肿瘤细胞血管生成等途径发挥抗肿瘤作用[11-13]。桂明杰等[14]报道，LNT具有抑制人肝癌细胞HepG2增殖的作用；颜亚楠等[15]发现，利用LNT可通过下调B淋巴细胞-2表达，同时促进Bcl-2相关X蛋白表达，诱导口腔鳞癌细胞凋亡；还有研究表明，LNT可通过阻滞肿瘤细胞异常增殖信号通路抑制肿瘤细胞增殖[16]。此外，张冬等[17]报道LNT明显抑制肝癌HepG2细胞体外侵袭。本研究结果表明LNT可抑制肝细胞BEL-7402和BEL-7402/S的增殖，其IC50值分别为129.912 mg/L和195.223 mg/L，这为LNT可抑制肝癌细胞增殖提供了进一步的实验数据。

LNT逆转肿瘤耐药的作用同样值得研究和探讨。已有研究报道，LNT可以逆转多种肿瘤耐药细胞株的耐药现象，包括LNT与吉西他滨联合应用对抑制膀胱肿瘤细胞增殖具有协同作用[18]；与紫杉醇联合应用可诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)表达，激活凋亡信号调节激酶1(apoptotic signal-regulated kinase 1, ASK1)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径协同发挥抑制A549增殖作用[19]。以上研究结果说明LNT可能是有效逆转肿瘤细胞多药耐药的药物，但是否可逆转索拉非尼耐药尚不清楚。本研究所建BEL-7402/S细胞株对索拉非尼的耐药指数为9.19，后续结果显示1、2、4、8 mg/L组的LNT在提高BEL-7402/S细胞株对索拉非尼敏感性方面无明显作用，而16 mg/L的LNT联合索拉非尼对BEL-7402/S细胞的抑制作用较单用索拉非尼明显增强。这提示LNT可以提高索拉非尼对肝癌细胞的敏感性。本研究结果还证实了与16 mg/L的LNT联合应用，索拉非尼对BEL-7402/S细胞IC50值为57.142 μmol/L，明显低于单用索拉非尼的IC50值(117.797 μmol/L)，相对逆转率RRR为 0.58。这表明LNT可部分逆转BEL-7402/S细胞对索拉非尼的耐药，深入研究LNT部分逆转索拉非尼耐药的作用机制，具有重要临床价值。

耐药是导致索拉非尼应用局限性的主要原因，其机制复杂且尚未被完全揭示。已有研究表明，缺氧微环境是肝癌的一个重要特征，也是诱导肝癌耐药的重要机制；肝癌缺氧微环境诱导HIF-1α表达，进而上调下游VEGF表达[20]。已往研究表明，HIF-1α和肿瘤多药耐药蛋白P-gp、MDR1在转录水平和蛋白表达密切相关，对肝癌细胞多药耐药至关重要[21]。VEGF是体内一种强效力的促血管生成因子，是HIF-1α的重要下游因子，能直接或间接参与血管生成，在肝癌的发生、转移和耐药中具有极其重要的地位。近年来有研究表明，抑制HIF-1α的表达则提高肝癌细胞对索拉非尼敏感性，逆转或部分逆转肝癌细胞对索拉非尼耐药[22]。据此推测，LNT是否可通过调控HIF-1α/VEGF通路影响肝癌细胞对索拉非尼的耐药并分别应用RT-qPCR 和Western blotting检测LNT对BEL-7402/S中HIF-1α及VEGF mRNA和蛋白表达的影响，结果证实，LNT对BEL-7402/S中HIF-1α及VEGF表达具有较明显的负性调控作用。这提示LNT可通过抑制BEL-7402/S细胞中HIF-1α及VEGF表达实现部分逆转BEL-7402/S细胞对索拉非尼的耐药。

综上所述，本研究的体外实验结果支持LNT能够部分逆转 BEL -7402/S细胞对索拉非尼的耐药，这可能与其抑制肝癌细胞中HIF-1α和VEGF的表达有关。但本研究仅为体外细胞学实验，因此，还需要进一步更全面的探究和确证。