筇竹组培快繁技术1)

郑静楠 董文渊 钟欢 尹泽南 吴义远

(云南省林业调查规划院，昆明，650051) (西南林业大学)

筇竹(Qiongzhueatumidinoda)为地下茎复轴混生的小型竹种，被列为国家三级保护的珍稀濒危竹种之一[1]，仅分布于中国的西南部分地区。筇竹具有极高的观赏、工艺、营养、生态和经济价值[2-4]。适宜筇竹生长的生态环境被长时间破坏，加剧了筇竹资源的衰退，其常规繁殖常采用扦插,繁殖系数较低,且易造成病毒的积累,而通过组培技术可在短期内获得大量健康苗木。对筇竹的组培技术进行研究,为今后科学化、规模化培育筇竹林提供一定的理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

试验材料为筇竹成熟种胚。

1.1 试剂及设备

自动双重纯水机、冰箱、自动高压蒸汽灭菌(YAMATO，SQ810C)、体视镜(Nikon，ECLIPSE E100)、显微镜(Feica，MDG33)、电子天平、超净工作台(苏净安泰)、紫外灯车(上海跃进)、恒温箱、培养皿等实验室常用仪器设备。

试验试剂；植物生长调节剂为2，4-D、KT、6-BA、NAA、IBA；MS大量元素、MS微量元素、铁盐、MS有机物、升汞、琼脂、酒精、次氯酸钠。

1.2 研究方法

1.2.1 试管苗无菌体系的建立

将挑选后并去外稃的种子，置于超净工作台上，设计9种灭菌消毒的方法，进行试验[5-8]。

方法1：体积分数75%酒精(浸泡)10 min→无菌水冲洗5次→体积分数0.1%升汞(8 min)→无菌水冲洗5次→吸干水分→接种。

方法2：体积分数75%酒精(浸泡)10 min→无菌水冲洗5次→体积分数0.1%升汞(15 min)→无菌水冲洗5次→吸干水分→接种。

方法3：体积分数75%酒精(浸泡)10 min→无菌水冲洗5次→0.2 mL氯酸钠(浸泡)15 min→无菌水冲洗5次→体积分数0.1%升汞(8 min)→无菌水冲洗5次→吸干水分→接种。

方法4：体积分数0.2%次氯酸钠(2 h)→体积分数75%酒精(15 min)→体积分数0.1%升汞(8 min)。

方法5：体积分数0.5%甲醛(2 h)→体积分数75%酒精(15 min)→体积分数0.1%升汞(8 min)。

方法6：体积分数0.2%次氯酸钠(12 h)→体积分数75%酒精(15 min)→体积分数0.1%升汞(8 min)。

方法7：体积分数0.5%甲醛(12 h)→体积分数75%酒精(15 min)→体积分数0.1%升汞(8 min)。

方法8：体积分数2.5%次氯酸钠(2 h)→体积分数75%酒精(15 min)→体积分数0.1%升汞(8 min)。

方法9：体积分数2.5%甲醛(2 h)→体积分数75%酒精(15 min)→体积分数0.1%升汞(8 min)。

种子消毒后，将种子置于接种盘上进行解剖，选取筇竹种胚为外植体，接种于空白MS，pH值为5.6～5.8的培养基中，每种消毒方法接种于3组培养基中，每组设置15个组培瓶，每个组培瓶接种1颗种子，共45颗，培养条件为(25±1)℃、光照2 000 lx、光照时间12 h·d-1，观察记录各处理的种子在接种5、12、20 d的污染和萌发情况。

1.2.2 试管苗丛芽诱导

以筇竹种胚作为外植体，接入丛芽诱导培养基中进行诱导培养。诱导培养基以MS，pH值5.6～5.8为基础培养基，生长调节剂选用6-BA1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg·L-15个质量浓度水平和NAA0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·L-15个质量浓度水平，自由组合(表1，表2)，为25个自由组合进行试验，筛选适宜丛生芽诱导的生长调节剂种类及配比，每个处理接种45瓶，每瓶1个种胚，每个处理重复3次[9-15]。培养条件同上，30 d左右进行观察和统计丛芽诱导结果。

表1 不同植物生长调节剂的丛生芽诱导

1.2.3 丛生芽增殖培养基筛选

为了使丛生芽得到大规模、快速繁殖，需要在原代培养丛生芽的基础上进行继代增殖。由于各种植物生长调节剂之间可能存在相互作用，以MS培养基、6-BA质量浓度、NAA质量浓度、KT质量浓度为4因素，每个因素3水平L9(34)进行正交设计方案，探索更为准确的丛生芽增殖配方[16-21]。设置9个处理，每个处理重复3次，30 d后统计结果，具体设计方案见表3和表4。取诱导出的长势一致的无菌丛芽，接于提前配置好的培养基中，每瓶接1丛，每组25瓶，每个处理重复3次。

表2 诱导丛生芽的设计方案

表3 不同植物调节剂对丛芽增殖影响的试验设计

表4 丛芽增殖试验设计方案L9(34)

1.2.4 生根诱导

以1/2MS作为基础培养基，添加不同质量浓度和配比的6-BA、NAA和IBA植物生长调节剂组合设计到培养基中。其中植物生长调节剂6-BA质量浓度分别为0.3、0.5、0.8 mg·L-1；NAA质量浓度分别为1.0、1.5、2.0 mg·L-1；IBA质量浓度分别为0.1、0.5、1.0 mg·L-1(表5)。通过3因素3水平正交设计L9(33)(表6)，每瓶接种一个筇竹苗丛，每个处理接种25瓶，重复3次，详见表6。在前一阶段的继代培养中选取分化长2.0 cm以上的无根筇竹小苗，接种于表6的生根培养基中诱导生根，试图找到最佳的生根壮苗试验配方[21-24]。

表5 不同植物调节剂生根诱导的试验设计

表6 不同植物调节剂生根壮苗的正交设计方案

1.2.5 炼苗移栽

将组培瓶瓶盖打开，置于常温室内自然散射光下进行炼苗，炼苗3～5 d后，选择挑选生长良好、根系完整的组培苗取出，洗净根部附着的琼脂，以腐殖土、珍珠岩和河沙为原料，配置3种不同的基质(表7)，然后将组培苗从组培瓶中移栽到不同基质中。30 d后观测记录成活率及生长情况，比较不同基质对移栽成活率的影响。

表7 移栽基质及其组成成分

2 结果与分析

2.1 外植体无菌体系的建立

由于筇竹种子被稃叶包裹，胚位于果基部，消毒液不易浸入，加之稃叶易生长各种霉菌。在选用了3种组培常用的基本消毒方法基础之上再设置了5种消毒方法处理，分别接种到MS空白培养基上，20 d后统计污染与成活率(表8)。

表8 不同处理对外植体消毒效果的影响

由表8可知，单一组织消毒方法的效果较组合消毒试剂浸泡处理后的效果差，消毒试剂浸泡后，污染率随之降低。为了进一步证明不同处理对筇竹外植体的影响，对污染率、萌芽率及成活率进行分析，效果详见表8。

从表8可以看出，随着所使用消毒试剂种类、质量浓度及浸泡时间的增加，材料污染率随之降低，但萌芽率及成活率也受到了影响；用体积分数0.2%的次氯酸钠对种子进行浸泡比直接用酒精浸泡效果好，原因是酒精对种胚有一定的刺激作用，产生伤害；用体积分数0.2%次氯酸钠和体积分数0.2%甲醛浸泡比体积分数2.5%次氯酸钠和体积分数0.2%甲醛浸泡效果好，研究发现，高体积分数浸泡可使污染率降低，但萌芽率和成活率显著下降；使用体积分数0.2%次氯酸钠和体积分数0.5%甲醛浸泡12 h和浸泡2 h萌芽率和成活率差异不大，但浸泡12 h后污染率却显著降低；且使用体积分数0.5%甲醛的萌芽率和成活率比体积分数0.2%次氯酸钠高，污染率低，对种胚的伤害也相对较小，整体效果好。

结果表明，单用酒精、次氯酸钠、甲醛、升汞中的任何一种试剂的效果比组合使用消毒效果差。因此，灭菌消毒的方法7为最佳消毒方式，即采用体积分数0.5%甲醛(12 h)→体积分数75%酒精(15 min)→体积分数0.1%升汞(8 min)的处理效果为理想，种胚污染率为3.33%，萌芽率为86.21%，成活率为83.33%。

2.2 不同生长调节剂对丛芽诱导的影响

筇竹丛芽经过不同生长调节剂30 d的诱导，不同质量浓度6-BA对筇竹萌芽率、丛芽诱导率有一定的影响(表9)，随着6-BA质量浓度的增加，种胚萌芽率呈下降趋势，丛芽诱导率先增加后减少。当6-BA质量浓度为2.0 mg·L-1时萌芽率、丛芽诱导率为最高。

由表10可知，不同质量浓度6-BA对丛芽种胚丛芽诱导率影响差异显著，对萌发率影响差异不显著。

表9 不同质量浓度6-BA对丛芽萌芽率和诱导率的影响

表10 不同质量浓度6-BA对丛芽诱导的方差分析

表11 不同质量浓度NAA对萌芽率、丛芽诱导率的影响

由表11、表12可以看出，不同质量浓度的NAA对筇竹的萌芽率、丛芽诱导率的影响均差异不显著，当NAA质量浓度为0.2 mg·L-1时的萌芽率、丛芽诱导率最高。由此得出，筇竹丛芽诱导率同时受到种胚的萌芽率和丛芽诱导率指标的影响，基于丛芽诱导率考虑，可以将MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA看作较好的试验组合，该组合丛芽诱导率最高，为66.67%。

表12 不同质量浓度NAA对筇竹丛芽诱导的方差分析

2.3 不同植物生长调节剂组合对筇竹丛生芽增殖的影响

取长势良好的筇竹试管丛生苗接入表4的不同处理的培养基中，30 d后记录统计丛生芽增殖倍数，试验结果见表13、表14。

由表13和表14可以看出，各水平之间差异略显著。4个因素中，极差(R)值最大的是KT因素，最小的是NAA因素和6-BA因素，4个因素对筇竹丛生芽苗增殖倍数的影响由大到小的顺序为KT、培养基、NAA、6-BA。因此，随着KT质量浓度的逐渐增加，丛生芽的增殖倍数先减后增，当KT质量浓度为1.0 mg·L-1时增殖倍数达到最大，对试验结果进行方差分析，深入确定试验因子及其各水平对试验结果的影响程度(表15)。

表13 丛生芽增值倍数正交试验结果的直观分析

表14 丛生芽增值倍数正交试验结果K值优水平

表15 筇竹丛芽增殖倍数正交试验结果方差分析

方差分析结果与极差分析结果趋势一致，6-BA、NAA质量浓度对分化丛芽的增殖影响极显著。而KT质量浓度对分化丛芽增殖的影响不显著，说明6-BA和NAA具有很重要的作用。对观测到的增殖情况和试验数据进行综合分析，研究认为，适合筇竹分化丛芽增殖的培养基配方为1/2MS+0.3 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA。

2.4 不同植物生长调节剂组合对再生植株诱导生根的影响

以1/2MS培养基为基础培养基，将诱导分化出的健康芽丛长成的小植株转入表6的不同处理的生根培养基中，30 d后记录统计平均生根率，并对生根率进行直观分析和方差分析(表16)。

由表16和表17可知，试验3个因素中R值最大的是NAA因素，最小的是6-BA因素，3个因素对筇竹生根率的影响由大到小的顺序为NAA、IBA、6-BA，因此，NAA质量浓度对生根率的影响最大。

表16 植物生长调节剂生根试验统计

表17 植物生长调节剂生根正交试验结果K值优水平

诱导丛生芽生根在竹类植物组培快繁中占据重要地位，是其试管快繁成功的关键。在诱导生根的过程中，培养基内仅添加一种植物生长调节剂易使丛生芽发生褐化甚至死亡，且生根率不高，植株长势不良，配合其他细胞分裂素的培养基在褐化、生根率及植株长势上均有明显提高，究其原因可能是细胞分裂素抑制了叶绿素的降解，对竹类植物的叶片保持活力，且细胞分裂素对氨基酸等营养物质的运输有一定作用，进而延缓植物组织的老化。所以在诱导生根的过程中，将植物生长素与细胞分裂素的配合使用显得尤为重要。从筇竹组培苗长势、炼苗与移栽后的效果，结合生根率、生根数和根系质量综合分析，确定出筇竹组培苗最优培养基为1/2MS+0.3 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1IBA。

2.5 不同基质对筇竹组培苗移栽成活率的影响

炼苗移栽30 d，在m(河沙)∶m(腐殖土)=1∶2的基质中成活率为40%，筇竹移栽苗生长缓慢，部分顶端叶片发黄；在m(珍珠岩)∶m(腐殖土)=1∶2的基质中成活率为60%，筇竹移栽苗长势良好，叶片深绿色；在m(河沙)∶m(珍珠岩)∶m(腐殖土)=1∶1∶2的基质中成活率达到90%，且苗生长健康茂盛，叶片深绿色(表18)。由此可以看出，筇竹移植苗在m(河沙)∶m(珍珠岩)∶m(腐殖土)=1∶1∶2的成活率最高，且苗生长状况最佳，在规模化进行移栽时，应选用m(河沙)∶m(珍珠岩)∶m(腐殖土)=1∶1∶2的基质进行移植。

表18 不同基质对筇竹组培苗移栽成活率的影响

3 结论与讨论

筇竹外植体单一组织消毒方法的效果较组合消毒试剂浸泡处理后的效果差，不同消毒试剂种类、质量浓度及浸泡时间长短对其萌芽率和成活率具有直接的影响。研究结果表明，单用酒精、次氯酸钠、甲醛、升汞中的任何一种试剂对筇竹外植体消毒的效果比组合使用消毒效果差，采用体积分数0.5%甲醛(12 h)→体积分数75%酒精(15 min)→体积分数0.1%升汞(8 min)的处理效果最为理想，种胚污染率为3.33%，萌芽率为86.21%，成活率为83.33%。

在不同生长调节剂对筇竹丛芽诱导的影响方面，不同质量浓度的NAA对筇竹的萌芽率、丛芽诱导率的影响均差异不显著。研究表明，只有当NAA质量浓度为0.2 mg·L-1时的萌芽率、丛芽诱导率最高，即MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的试验组合筇竹丛芽诱导率最高，达到66.67%。

筇竹丛生芽增殖的影响在不同植物生长调节剂组合的影响下，KT质量浓度是筇竹丛生芽增殖倍数的决定性影响因子，随着KT质量浓度的逐渐增加，丛生芽的增殖倍数先减后增，当KT质量浓度为1.0 mg·L-1时增殖倍数达到最大。研究表明，6-BA、NAA质量浓度对分化丛芽的增殖影响极显著，最适合筇竹分化丛芽增殖的培养基配方为1/2MS+0.3 mg·L-1NAA+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA。

在利用不同植物生长调节剂对筇竹诱导生根的过程中，培养基内仅添加一种植物生长调节剂易使丛生芽发生褐化甚至死亡，且生根率不高，植株长势不良，配合其他细胞分裂素的培养基在褐化、生根率及植株长势上均有明显提高，研究认为，由于细胞分裂素抑制了叶绿素的降解，同时细胞分裂素促进氨基酸等营养物质的运输，进而延缓筇竹组织的老化。在筇竹组培苗生长、炼苗与移栽后进行观察试验，确定最优培养基为1/2MS+0.3 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1IBA。另外，筇竹移植苗在m(河沙)∶m(珍珠岩)∶m(腐殖土)=1∶1∶2基质中的成活率最高，且苗生长状况最佳，可以应用于规模化进行移栽。

由于筇竹离体快繁中种胚需要在无菌的条件下进行组培，生产环境要求较高；不同的消毒组合对筇竹种胚的污染率、萌芽率和成活率有不同程度的影响，本研究设置9种消毒组合方式有一定的局限性，消毒的组合方式有待进一步探究；试验设计时采用的KT质量浓度跨度不够明显，还需进一步设置大梯度KT质量浓度对生根培养基进行筛选。