氟尿嘧啶对膝骨关节炎模型大鼠膝关节软骨、滑膜损伤的影响

肖莉莉 林煜 郑世雄 林丽琼 冯尔宥 王武炼

【摘 要】目的：通过观察氟尿嘧啶对膝骨关节炎大鼠软骨基质成分的影响，探讨其对早期膝骨关节炎的疗效。方法：采用改良Hulth法切除前交叉韌带、切断和切除内侧半月板造模，空白对照组仅切开后缝合，模型对照组和氟尿嘧啶组均按上述方法造模，每组12只。术后6周，空白对照组和模型对照组在膝关节腔内注射生理盐水对照，氟尿嘧啶组膝关节腔内注射重组氟尿嘧啶注射液2 mg·kg-1。HE染色在光学显微镜下观察关节软骨组织变化，甲苯胺蓝软骨基质染色后按照Mankin评分标准进行病理评分，采用免疫组织化学染色对膝关节软骨骨桥蛋白的表达进行半定量分析，并用ELISA试剂盒检测滑膜组织钙结合蛋白S100A12、一氧化氮（NO）、白细胞介素-1β（IL-1β）和半乳糖凝集素3（galectin-3）的表达。结果：氟尿嘧啶组大鼠膝骨关节炎模型滑膜中钙结合蛋白S100A12、NO、IL-1β、galectin-3含量较模型对照组明显减少，软骨中骨桥蛋白的表达也较模型对照组减少，差异有统计学意义（P < 0.05）;同时关节滑膜的炎症反应也明显减轻。结论：通过关节腔注射氟尿嘧啶治疗大鼠膝骨关节炎模型，能够改善病变关节内的微环境，抑制滑膜炎症，减少关节滑液中致炎因子，从而延缓关节软骨退变，有较好的治疗作用。

【关键词】 膝骨关节炎;氟尿嘧啶;软骨基质成分;形态学;大鼠

【ABSTRACT】Objective：By investigating the effect of fluorouracil on the composition of cartilage matrix in rats with knee osteoarthritis to explore its curative effect on early knee osteoarthritis.Methods：The modified Hulth method was used to cut the anterior cruciate ligament and cut off the medial meniscus.Those in the blank control group were only cut and sutured.The model control group and the fluorouracil group were modeled according to the above methods，with 12 rats in each group.Six weeks after operation，normal saline was injected into the knee joint of the blank control group and the model control group，and recombinant fluorouracil injection（2 mg·kg-1）was injected into the knee joint of the fluorouracil group.HE staining was used to observe the changes of articular cartilage under the light microscope.Toluidine blue cartilage matrix staining was followed by pathological scoring according to the Mankin scoring standard.The expression of osteopontin in knee cartilage was semi-quantitatively analyzed by immunohistochemical staining，and the calcium binding protein S100A12，nitric oxide（NO），interleukin-1β（IL-1β）and galectin-3 in synovial tissue were detected by ELISA kit.Results：The contents of calcium binding protein S100A12，NO，IL-1β and galectin-3 in synovium of the fluorouracil group were significantly lower than those in the model control group，and the expression of osteopontin in cartilage was also lower than that in the model control group，the difference being statistically significant（P < 0.05）;At the same time，the inflammatory reaction of joint synovium was also significantly reduced.Conclusion：Intra articular injection of fluorouracil in the treatment of rat knee osteoarthritis model can improve the microenvironment in the diseased joint，inhibit synovial inflammation，reduce inflammatory factors in joint synovial fluid，so as to delay the degeneration of articular cartilage.

【Keywords】 knee osteoarthritis;fluorouracil;cartilage matrix components;morphology;rats

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是老年人最常见的慢性病之一，是导致关节疼痛和残疾的主要原因[1]。KOA发展过程中，软骨破坏与修复是一个复杂的过程，需要多种酶及因子的协调和参与，而各种细胞因子的产生和运作可能因疾病的持续时间和严重程度而有所不同[2]。在承受高机械负荷的膝关节组织中，由于平衡被破坏，关节软骨会发生进行性退变，从而导致KOA的产生[3];同时滑膜亦呈显著变化，甚至发生在软骨变性之前，可能是KOA发生的独立危险因素。因此，KOA病理改变涉及关节内的软骨细胞、细胞外基质、软骨下骨分解以及关节周围滑膜、关节液，甚至关节的所有组织。滑膜组织钙结合蛋白S100A12、一氧化氮（NO）、白细胞介素-1β（IL-1β）和半乳糖凝集素3（galectin-3）是早期参与关节滑膜炎性病变及软骨基质降解的重要细胞因子[4]。

当前，在膝关节内注药预防和减轻KOA病理改变的研究中，氟尿嘧啶为细胞毒性抗代謝药物，可特异性地作用于增生的滑膜细胞，抑制滑膜细胞增殖，减少细胞炎症因子[5]。本研究为进一步探讨氟尿嘧啶对早期KOA的作用机制，采用氟尿嘧啶给予大鼠Hulth法KOA模型进行关节腔注射，对软骨基质成分的组织化学染色图像进行定量分析，并检测滑膜组织炎性细胞因子及galectin-3的表达变化，探究氟尿嘧啶对早期KOA的作用，以期为临床应用提供参考。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠36只，2月龄，体质量（250±10）g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号SCXK（沪）2012-0002。

1.2 实验药物 氟尿嘧啶注射液[上海旭东海普药业有限公司，国药准字H31020593，规格0.25 g·（10 mL）-1]。

1.3 实验试剂 二甲苯、氨水、甲苯胺蓝、中性树胶、过氧化氢（国药集团化学试剂有限公司）;苏木素-伊红（HE）染液（武汉谷歌生物科技有限公司）;质量分数为4%的多聚甲醛（默克Sigma-aldrich公司）;质量分数为10%的乙二胺四乙酸（EDTA，汇融化工）;阿尔新蓝[生工生物工程（上海）股份有限公司];PAS染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）;切片刀（Leica，德国）;钙结合蛋白S100A12、NO、IL-1β、galectin-3，ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.4 实验仪器 纯水机（西安优普，UPT-II-5/10/20T）;精密电子天平（北京赛多利斯，BSA124S）;生物组织脱水机（上海缳希，TS-12U）;石蜡包埋机（北京佳源兴业，BM-VⅡ）;石蜡切片机（北京长恒荣创，RM2255）;摊片烤片一体机（孝感亚光，YT-7FB）;正置显微镜（德国徕卡，DM4000B）;显微图像分析系统（德国麦克奥迪，Motic Med 6.0）;超低温冰箱（青岛海尔，DW-86L626）;台式离心机（安信仪器，1-14）;冷冻高速离心机（德国赛默飞，Legend Micro 17R）;低速离心机（湖南湘仪，L-530）;移液枪（美国，Dragon）;显微镜成像系统（日本奥林巴斯公司，DP72）;超低温冰箱（日本三洋公司，DF-382E）;电热恒温水箱（上海精宏实验设备有限公司，DK-8B）。

2 方 法

2.1 造模、分组及处理 将36只SD大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、氟尿嘧啶组，每组12只。术前12 h禁食不禁水，称重，采用质量分数为2%的戊巴比妥钠（默克医疗）进行腹腔注射麻醉，选取左膝关节备皮，碘伏（朗索医药）消毒，模型对照组、氟尿嘧啶组采用改良Hulth法[6]切除前交叉韧带、切断和内侧半月板造模，空白对照组仅切开后缝合。术后6周，每组各取2只大鼠脱颈处死，取材，采用组织学和生物化学等技术对关节软骨和关节液进行评估模型是否成立。造模成功后，空白对照组和模型对照组在膝关节腔内注射生理盐水对照，氟尿嘧啶组膝关节腔内注射重组氟尿嘧啶注射液2 mg·kg-1，连续干预15 d后取材。

2.2 光学显微镜制样观察 动物麻醉后，立即取出完整的膝关节，打开膝关节腔，切取关节软骨，生理盐冲洗干净，采用质量分数为4%的多聚甲醛固定，质量分数为10%的EDTA脱钙，将浸好蜡的膝关节软骨组织放入包埋机内包埋，-20 ℃冻台冷却凝固，按照厚度4 μm连续切片，切片部位包含负重关节面全层软骨。分别进行HE染色，并在光学显微镜下观察关节软骨组织变化，对软骨按照Mankin评分标准进行病理评分[6];采用质量分数为0.5%的甲苯胺蓝染色液染色，观察关节软骨蛋白多糖变化;采用免疫组化法染色，对膝关节软骨骨桥蛋白的表达进行半定量分析。

2.3 ELISA检测 将滑膜组织加稀释液研磨成碎片，采用ELISA试剂盒检测滑膜中组织钙结合蛋白S100A12、NO、IL-1β、galectin-3的表达，按照说明书的步骤进行操作;在酶标仪上读取450 nm处吸光度值，绘制标准曲线并计算结果。

2.4 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）;不符合正态分布采用非参数检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 关节软骨HE染色病理学变化 空白对照组关节软骨呈半透明的浅蓝色，表面光滑富有弹性，无裂纹、缺损及硬化。模型对照组软骨呈浅黄色，表面无弹性，粗糙，部分部位出现裂纹及缺损。氟尿嘧啶组关节软骨大多呈半透明色，偶见斑片状黄色，但未见明显裂纹或缺损。空白对照组HE染色见膝透明软骨的切线层、移行层、放射层和钙化层结构分明，光滑而未见裂隙及缺损，各层细胞结构清晰，基质染色均匀，未能良好显示潮线，见图1（1）。模型对照组软骨面可见缺损达移行层，部分可至放射层，缺损下方部分软骨陷窝内未见细胞核，移行层、放射层细胞体积增大，数量减少，排列较规则，未见明显紊乱，细胞囊、软骨基质未见明显苏木素着色，钙化层细胞体积增大，基质染色不均，见图1（2）。氟尿嘧啶组软骨表面较光滑，无明显缺损，移行层、放射层较空白对照组增厚，但排列较规则，基质染色较均匀，见图1（3）。

3.2 甲苯胺蓝软骨基质染色结果 空白对照组软骨基质呈深蓝色，各层染色均匀，表明软骨中含蛋白多糖，见图2（1）;模型对照组各层未见明显着色、多层次染色分布不均匀，见图2（2）;氟尿嘧啶组较模型对照组深染，但仍然淡于空白对照组，染色以放射层为显著，见图2（3）。图像半定量结果显示，空白对照组蛋白多糖含量最高，氟尿嘧啶组次之，模型对照组最低。见表1。

3.3 3组Mankin评分比较 根据Mankin评分标准[5]，模型对照组Mankin得分最高，氟尿嘧啶组次之，空白对照组最低。氟尿嘧啶组、模型对照组与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）;氟尿嘧啶组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3.4 3组膝关节软骨骨桥蛋白表达比较 大鼠膝关节软骨中的骨桥蛋白经过免疫组化染色呈棕黄色为阳性，无棕黄色染色为阴性。空白对照组软骨呈弱阳性表达，见图3（1）;模型对照组软骨细胞体积明显增大，胞质呈强阳性染色，见图3（2）;氟尿嘧啶组较模型对照组阳性染色面积少，部分呈斑片状散布于各层，见图3（3）。图像半定量分析显示，空白对照组最低，氟尿嘧啶组次之，模型对照组最高（P < 0.05）。见表3。

3.5 3组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、NO、IL-1β、galectin-3水平比较 滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、NO、IL-1β、galectin-3水平以模型对照组最高，空白对照组最低，氟尿嘧啶组居中。各组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

4 讨 论

KOA是关节最常见的慢性病，且被认为是潜在不可逆疾病[7-8]。S100A12、NO、IL-1β、galectin-3是重要的早期参与膝关节滑膜炎性病变及软骨基质降解的细胞因子，对膝关节软骨分解代谢和合成代谢起重要作用[9]。IL-1β是KOA致病的关键细胞因子之一，独立地引起炎症反应和分解代谢[10]，影响细胞和细胞外基质（ECM）代谢软骨细胞，干扰关键结构蛋白（如Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖）的合成，并且能和肿瘤坏死因子-α协同，产生诱导型一氧化氮合酶的NO，对软骨产生负面影响[11-13]，同时NO也促进IL-1β表达，而IL-1β也可通过NO促使人软骨细胞基质金属蛋白酶-3（MMP-3）的合成，从而抑制软骨细胞增殖作用[14]。KOA患者血液及关节外组织中分泌的S100A12进入血液循环后，到达患者的关节周围组织如滑膜，则可促进滑膜炎的产生，且骨关节炎严重程度与S100A12的表达水平呈正相关[15]。galectin-3具有调节间充质干细胞MSC免疫的特性，并降低KOA发生过程中的免疫应答[16-18]。KOA发生过程中，与正常软骨相比，galectin-3的基因表达显著增加[19-20]。而在KOA患者的滑膜和关节软骨中也同样检测到galectin-3的表达增加[21-22]。OPN与KOA发生过程中NO、IL-1β、MMPs等炎症因子的产生密切相关[23]。本研究通过改良Hulth法复制大鼠膝OA模型，发现模型对照组滑膜组织中钙结合蛋白S100A12、NO、IL-1β、galectin-3水平高于空白对照组（P < 0.05），HE染色及免疫组化染色结果表明模型成立，同时S100A12、NO、IL-1β、galectin-3也可以作为判断关节滑膜炎症反应的指标。

氟尿嘧啶为嘧啶类氟化物，是细胞毒性抗肿瘤药物，也是细胞毒性抗代谢药物，其作用于细胞增殖周期的S期，通过干扰DNA合成抑制细胞分裂[24]，主要是可特异性地作用于增生的滑膜细胞，抑制滑膜细胞脱氧核糖核酸合成，终止滑膜细胞的有丝分裂，减少滑膜细胞分泌NO、IL-1β、MMPs等炎症因子[25]。同时有研究低剂量氟尿嘧啶不会抑制正常的软骨细胞的分裂，且有利于维持正常软骨细胞内外水分的稳态，改善关节软骨生存的微环境，参与损伤的修复[26]。此外，该药还可减少基质的诱导MMPs生成，减轻和缓解对软骨的破坏。氟尿嘧啶作为治疗KOA的一种较新药物，具有显著的镇痛作用，可改善膝关节功能[27]，表明在KOA关节腔注射疗法中有使用氟尿嘧啶的可能性。通过关节腔注射氟尿嘧啶干预大鼠KOA模型关节软骨退变的研究，发现关节腔注射氟尿嘧啶后组织形态学结果显示，氟尿嘧啶组的关节软骨破坏程度较模型对照组轻，未见明显裂纹或缺损，且膝透明软骨的切线层、移行层、放射层和钙化层结构分明;甲苯胺蓝软骨基质染色及半定量分析显示，氟尿嘧啶组软骨基质蛋白多糖含量较模型对照组高，但低于空白对照组（P < 0.05）。且氟尿嘧啶组滑膜中钙结合蛋白S100A12、NO、IL-1β、galectin-3含量较模型对照组明显减少。

上述结果提示，关节腔注射氟尿嘧啶治疗大鼠KOA模型，能够改善病变关节内的微环境，抑制滑膜炎症，减少关节滑液中致炎因子，从而延缓关节软骨退变，有较好的治疗作用。本研究存在一定局限性，未将常用关节腔注射药物玻璃酸钠和二甲基亚砜进行对比，未能评估干预后一段时间软骨及滑膜修復情况，下一步研究将引入富含血小板血浆治疗进行对照，加大样本量及分阶段取材进一步验证。

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收稿日期：2021-07-12;修回日期：2021-08-15