临颍县辣椒大田病害调查及主要病害的病原鉴定

李小杰 邵欣欣 白静科 李胜利 刘畅 李淑君 郭艳春

摘    要：针对近年来临颍县辣椒病害日益严重、防治困难等问题，为明确病害发生种类，2020年6—9月对临颍县辣椒病害进行调查，采集具有典型症状的病害样品进行病原鉴定。调查结果表明，临颍县辣椒病害有病毒病、根腐病、疫病、立枯病、根结线虫病、早疫病、炭疽病和黑斑病等8种，其中，根茎部病害以根腐病为主，叶部病害以病毒病和早疫病为主，果实病害以炭疽病为主。对主要病害进行病原鉴定和致病性测定，将辣椒根腐病的病原鉴定为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum），病毒病的毒原有烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV ）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY），早疫病的病原为链格孢菌（Alternaria alternata）。炭疽病的病原为喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii），是引起辣椒炭疽病的初次报道。试验结果为辣椒病害的准确识别和精准防控提供了理论依据。

关键词：辣椒;临颍县;病害调查;病原;致病性

中图分类号：S641.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）12-010-06

Abstract： In view of the increasingly serious pepper diseases and difficult control in Linying county in recent years， the diseases of pepper in Linying county were investigated from June to September 2020， and the disease samples with typical symptoms were collected for pathogen identification. The results of the survey showed that there were 8 kinds of pepper diseases including viral diseases， Phytophthora blight， root rot， root-knot nematode， damping off ， early blight， anthracnose and black spot. Among them， root rot was the main disease in rhizome， viral diseases and early blight were the main diseases in leaf， and anthracnose was the main disease in fruit. The pathogen of pepper root rot was identified as Fusarium oxysporum. Viral diseases include Tobacco mosaic virus， Cucumber mosaic virus and Potato virus Y. The pathogen of early blight was identified as Alternaria alternata. It was the first report that pepper anthracnose was caused by Colletotrichum Karstii. This study provides theoretical basis for the identification and prevention of pepper diseases.

Key words： Pepper; Linying county; Disease investigation; Pathogen; Pathogenicity

辣椒（Capsicum annuum）属茄科一年生草本植物，是我国重要的经济作物，具有极高的营养价值和经济价值。近年来，随着辣椒种植结构的不断变化以及受连作障碍和气候条件等的影响，辣椒病害日趋严重且呈现复杂化[1-2]。目前，已报道的辣椒病害有10余种，其中苗期病害主要有病毒病、猝倒病、立枯病、灰霉病等，成株期病害主要有青枯病、疫病、枯萎病、炭疽病等[3-6]，严重影响辣椒的产量和品质。辣椒疫病、枯萎病和炭疽病是辣椒生产中发生普遍且危害较为严重的几种病害，常造成巨大经济损失[7-9]。

引起辣椒病害的病因、病原不同，防治方法也有所不同。同时，因为有些病害症状非常相似，很难用肉眼区分，给病害的精准防控带来巨大困难。因此，准确识别田间病害种类，对病害的防控十分重要。河南省是我国朝天椒（俗称小辣椒）种植面积最大的省份，临颍县又是全省重要的朝天椒基地，种植面积2.0万hm2以上，年产干辣椒10万t以上，是当地的主要经济作物和重要经济来源[10]。但隨着连作和种植年限的增加，辣椒病害日趋严重，尤其是盛花期及果实生长期遇到高温多雨天气，易造成病害发生与传播，导致大面积落花落果，已成为制约朝天椒产量和品质提高的主要因素。笔者于2020年6—9月对临颍县朝天椒生产基地进行了病害调查，采集典型症状病害样本进行病原鉴定，以期为临颍县及河南辣椒病害防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 病害调查及样本采集

2020年6—9月，分别于苗期、开花结果期对临颍县辣椒生产基地的辣椒病害进行调查，采集具有典型症状的病害样本117份。其中，疑似病毒病样本37份、根茎部样本55份、叶部样本9份、果实样本16份（表1），分别装于牛皮纸袋中，放入装有冰袋的低温保藏箱中立即带回实验室进行病原分离鉴定。

1.2 病原真菌的分离纯化

采用组织分离法，切取病健交界处病组织，置于PDA培养基中，25 ℃恒温培养2～3 d。待菌丝长出后，挑取目的菌丝放入新的PDA培养基中培养，即得纯化菌株。观察分离菌株的形态特征、菌丝及孢子形态。

1.3 病原真菌的分子鉴定

参照真菌基因组DNA柱式提取试剂盒说明书，提取分离菌株基因组DNA作为模板，应用真菌鉴定通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）、β-微管蛋白基因引物TUB2-F（AACATGCGTGAGATTGTAAGT）和TUB2-R（ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC）进行PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）：DNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，2×PCR Taq MasterMix 12.5 μL，双蒸水补足到25 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 1 min，30个循环;72 ℃ 10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，将胶回收后委托生工生物有限公司进行测序。将获得的各基因序列与GenBank中的序列进行比对分析，选择同源性较高的序列用MEGA 7软件中的Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.4 病毒种类的分子鉴定

利用Trizol（Thermo Fisher Scientific）法提取不同辣椒病毒病样本总RNA，具体方法参照说明书。按照反转录试剂盒（PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）说明书，将病毒RNA合成双链cDNA作为模板，利用TMV、CMV、PVY和TEV特异性引物[11]进行PCR扩增。PCR反应体系同1.3。PCR反应条件为：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性40 s，51 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共30个循环;72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。

PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，将胶回收后委托生工生物有限公司进行测序，并将序列在GenBank数据库中进行Blast比对分析。

1.5 病原真菌的致病力测定

含菌麦粒接种法：将小麦清洗干净煮至喝饱水未开花状态，控水后称取200 g装入18×36×5丝规格的透明食用菌栽培袋中，用配套的套环封口，置于培养箱中28 ℃，70%湿度避光培养7 d，培养过程中每隔1 d摇晃食用菌栽培袋换气。将直径8.5 cm、高7 cm小花盆里装入一半花盆的基质，每花盆放入10 g培养好的含菌种麦粒，再补放基质至花盆满，移入辣椒苗，日常管理。10 d后观察发病情况。

刺伤接种法：选择健康的辣椒果实，用灭菌的针头刺伤其表面，然后切取1 cm×1 cm的真菌菌丝块貼于刺伤的果实表面，用脱脂棉蘸取无菌水保湿24 h，7 d后观察发病情况。

2 结果与分析

2.1 临颍县辣椒病害发生概况

通过对临颍县4个主要辣椒种植区的病害调查发现，临颍县辣椒病害有病毒病、根腐病、疫病、立枯病、根结线虫病、早疫病、炭疽病和黑斑病等8种（表2）。其中，辣椒病毒病发生较普遍，从苗期到成熟期均可发病，在生长前期危害严重，主要表现为植株矮化，叶片花叶、黄化、畸形等症状;辣椒根茎类病害主要有根腐病、疫病、立枯病和根结线虫病，其中，以根腐病发生较为严重，主要表现为植株矮小，叶片黄化萎蔫，根部变褐;辣椒叶果类病害主要是早疫病和炭疽病，在辣椒生长的各个时期均有发生，其中，以果实炭疽病发生较为普遍且危害严重。辣椒黑斑病零星发生，且多发生在日灼处。

2.2 辣椒主要病害的田间症状及病原鉴定

2.2.1 辣椒病毒病 辣椒病毒病的田间症状表现主要有花叶型：典型症状主要表现为病叶、病果出现不规则褪绿，呈现黄绿相间的斑驳，轻症植株生长正常，严重时植株生长缓慢或矮化（图1-a）;畸形：主要表现为叶面皱缩，叶缘向上卷曲，严重时叶片变成线状，后期植株上部节间短缩，呈丛簇状（图1-b）。对采集的37个疑似病毒病样本进行PCR扩增，其中，28份样本中同时扩增出TMV和CMV两种病毒的特异条带，6份样本中同时扩增出TMV、CMV和PVY三种病毒的特异条带（图1-c），1份样本中只检测到TMV的特异条带，2份样本中只检测到CMV的特异条带，各样本均未扩增出TEV病毒的特异条带。由此表明，临颍县辣椒病毒病的毒原主要有烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯Y病毒（PVY），且复合侵染率达到90%以上。

2.2.2 辣椒根腐病 辣椒根腐病的田间发病症状主要表现为病株地上部枝叶变黄萎蔫，拔出后发现根系变褐腐烂（图2-a），表皮易脱落。其中，样本编号为LJ-53的分离菌株在PDA培养基上，菌落为白色，菌丝茂密，呈疏松棉絮状（图2-b）。大型分生孢子镰刀形，无色，具3～5个隔膜;小型分生孢子卵形至肾形，单胞或双胞，无色（图2-c）。利用含菌麦粒接种法对菌株LJ-53进行回接，发病症状与田间症状相似（图2-d）。

分子鉴定结果表明，LJ-53分离菌株与尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）序列最大相似率为99.85%，且与Fusarium oxysporum Fo5176位于同一进化分支（图3）。

2.2.3 辣椒早疫病 辣椒早疫病的发病叶片上病斑呈圆形，黑褐色，有同心轮纹，潮湿时有黑色霉层（图4-a）。其中，从样本编号为LJ-60的病叶上分离的菌株在PDA培养基上，菌落呈圆形绒毛状，正面为灰色或灰黑色，背面为黑色（图4-b～c）。菌丝具隔，暗黑色，分生孢子砖隔或多隔，锥形（图4-d～f）。依据菌落和分生孢子特征，初步鉴定为链格孢菌（Alternaria）。

分子鉴定结果表明（图5），LJ-60分离菌株与链格孢菌（Alternaria alternata）序列最大相似率达99.92%，且与Alternaria alternata G408位于同一进化分支。

2.2.4 辣椒炭疽病 辣椒炭疽病可危害叶片、茎和果实。生长后期主要危害果实，且以成熟果受害较重。发病果实上呈圆形或不规则形病斑、稍凹陷，斑上生黑色小点，干燥时病斑常干缩似羊皮纸（图6-a）。其中，从样本编号为LJ-65的病果上分离的菌株在PDA培养基上，菌丝生长密实，正面初呈白色或黄色，有稍隆起的同心轮纹，上面着生小黑点，后期溢出淡红色黏状物（图6-b～c）。分生孢子盘无刚毛，分生孢子长椭圆形，无色，单胞（图6-d～f）。分子鉴定结果表明，LJ-65分离菌株与喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii）的同源性高达99.17%，且位于同一进化分支（图7～8）。利用刺伤接种法对LJ-65菌株进行回接验证，辣椒果实接种部位出现圆形凹陷病斑（图6-g），表明该菌株具有致病性，为辣椒炭疽病的病原。

3 讨论与结论

本研究调查结果表明，临颍县辣椒病害主要有病毒病、早疫病、根腐病、炭疽病、疫病及根结线虫病等。其中，病毒病在辣椒生长前期危害较重，且毒原种类复杂，复合侵染率较高，这与前人研究结果基本一致[12]，但本试验中只用了TMV、CMV、PVY和TEV四种病毒的特异引物进行了毒原种类检测，后期将增加分子检测的病毒种类。辣椒根腐病为辣椒常见的土传病害，在全国各地普遍发生，严重影响辣椒的产量和品质。引起辣椒根腐病的病原菌有尖镰孢菌（Fusarium oxysporum）、腐皮或茄病镰孢菌（Fusarium solani）、木贼镰孢菌（Fusarium equiseti）和串珠镰孢菌（Fusarium moniliforme）等，其中，以腐皮或茄病镰孢菌（Fusarium solani）为主[13-14]。笔者从临颍县发病辣椒根部分离出大量镰刀菌，且多数菌株具有较强的致病性，经鉴定均为尖孢镰刀菌，与前人报道有所不同，这可能与地域或品种差异有关。

目前，已报道的辣椒炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporoides）、黑色炭疽菌（Colletotrichum nigrum）、黑点炭疽菌（Colletotrichum capsici）、尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）和喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii）等15种左右，其中，以胶孢炭疽菌（C. gloeosporoides）和黑点炭疽菌（C. capsici）侵染较为普遍[15-17]。目前，国内外对其他植物炭疽病的病原菌C. karstii已有相关研究报道[18-20]，但未见在辣椒上的相关报道。笔者从临颍县发病辣椒果实上分离出的炭疽菌经鉴定为喀斯特炭疽菌（C. karstii），这是引起辣椒炭疽病的初次报道，是否还有其他炭疽菌种类，还需扩大取样范围和数量，进一步明确辣椒炭疽病的致病菌，并对其生物学特性及致病机制进行初步研究，为辣椒炭疽病的准确识别和防控提供理论依据。另外，在某些发病辣椒果实上能同时分离出炭疽菌和链格孢菌，且个别链格孢菌具有弱致病性，说明辣椒炭疽病和黑斑病可能混合发生，也有可能是炭疽菌侵染辣椒果实形成坏死病斑后造成链格孢菌腐生的结果。

笔者明确了临颍县辣椒病害主要有病毒病、根腐病、早疫病和炭疽病等，其中，病毒病的主要毒原有TMV、CMV和PVY，且复合侵染率较高;由尖孢镰刀菌（F. oxysporum）侵染引起的根腐病为辣椒的主要根茎部病害;由链格孢菌（A. alternata）引起的辣椒早疫病和炭疽菌（Colletotrichum sp.）引起的辣椒炭疽病是主要的叶果类病害，并初次报道了喀斯特炭疽菌（C. karstii）可引起辣椒炭疽病。本次试验结果为临颍县辣椒病害的准确识别提供了参考，对病害的精准防控具有指导意义。

参考文献

[1] 梁传静，邢丹，张爱民，等.不同栽培密度對辣椒产量及病害发生的影响[J].辣椒杂志，2020，18（3）：14-16.

[2] 李瑞娟.辣椒气候适应性与栽培管理及病害防治的综合分析[J].种子科技，2018，36（8）：81.

[3] 任宝强.辣椒生长过程中主要病害的防治措施[J].吉林蔬菜，2019（1）：34.

[4] 陈小均，陈文，谭清群，等.贵州省主要辣椒病害的诊断及综合防治[J].现代农业科技，2014（17）：163-164.

[5] 黄阔，张永强，刘烈花，等.辣椒主要病害田间诊断及发生规律[J].植物医生，2020，33（1）：69-71.

[6] 常耀军，王桂芳.原州区辣椒生长期病害调查及防治对策[J].现代农业，2017（1）：14-15.

[7] 易图永，谢丙炎，张宝玺，等.辣椒疫病防治研究进展[J].中国蔬菜，2002（5）：52-55.

[8] 田倍齐，龚晓丽，温芸芸，等.隆德县大田辣椒枯萎病气象条件分析[J].农业科技与信息，2020（13）：31-32.

[9] 周建波，殷辉，吕红，等.8种不同类型药剂对辣椒炭疽病的田间防治效果[J].中国瓜菜，2020，33（11）：72-76.

[10] 张涛，韩娅楠，张强，等.河南省朝天椒产业现状及发展对策[J].中国瓜菜，2020，33（1）：65-68.

[11] 郑轩，成巨龙，赵震，等.五种烟草病毒 TMV、CMV、TEV、PVY及TVBMV的多重RT-PCR同步检测[J].植物病理学报，2011，41（2）：146-153.

[12] 于海龙，靳远，刘婧，等.我国辣椒病毒病发生情况及发展趋势：基于2018年和2019年辣椒主产区的调查[J].中国蔬菜，2020（9）：25-30.

[13] 蔡高磊，赵昌松，彭宣和，等.十堰辣椒根腐病病原菌分离鉴定及高氏15号的生物防治作用研究[J].华中师范大学学报（自然科学版），2019，53（2）：248-254.

[14] 何佳佳，韩新才，何瑶，等.新型苯并咪唑类化合物对辣椒根腐病菌毒力的测定[J].辣椒杂志，2020，18（4）：16-19.

[15] 夏花，朱宏建，周倩，等.湖南芷江辣椒上一种新炭疽病的病原鉴定[J].植物病理学报，2012，42（2）：120-125.

[16] 王妮，尹显慧，彭丽娟，等.辣椒炭疽病病原鉴定及其杀菌剂毒力测定[J].植物保护，2019，45（4）：216-223.

[17] 杨佳文，赵尊练，张管曲，等.陕西线辣椒炭疽病原菌的鉴定及生物学特性研究[J].西北农业学报，2017，26（11）：1695-1705.

[18] ENAYRA S S，GABRIELA de S C，BEATRIZ M B，et al.First report of anthracnose on Spigelia anthelmia caused by Colletotrichum karstii and Colletotrichum siamense in Brazil[J].Journal of Plant Diseases and Protection，2021，128：875-880.

[19] XU X L，XIAO Q G，YANG C L，et al.First report of anthracnose caused by Colletotrichum karstii on Fatsia japonica in Sichuan，China[J].Plant Disease，2021，105（1）：216.

[20] 冉飞，高强，龙友华，等.贵州百香果炭疽病病原鉴定[J/OL].植物病理学报，2021：1-6[2021-04-08].DOI：10.13926/j.cnki.apps.000433.