GPSM1在结直肠癌中的表达及意义

陈阳 冉雯雯 王璐 宋瑶琳 李广起 邢晓明

[摘要] 目的 探討G蛋白信号调节蛋白1（GPSM1）在结直肠癌中的表达及意义。

方法 收集2015年4月—2016年4月青岛大学附属医院收治的150例原发性结直肠癌病人的石蜡组织样本及临床病理资料。采用免疫组织化学法检测GPSM1在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达，采用实时荧光定量PCR法检测结直肠癌病人石蜡组织样本中KRAS和NRAS的突变情况;分析GPSM1在结直肠癌组织中表达水平与病人临床病理特征及预后的相关性。

结果 结直肠癌组织中GPSM1的表达水平明显高于癌旁组织（χ2=102.938，P<0.001）。GPSM1在结直肠癌组织中的高表达与淋巴结转移（χ2=5.429，P=0.020）及KRAS突变（χ2=4.030，P=0.045）相关。生存分析结果显示，GPSM1高表达组结直肠癌病人的无病和总体生存期较GPSM1低表达组明显缩短（P=0.046、0.036）。

结论 GPSM1在结直肠癌组织中高表达，并且与病人不良预后相关，可作为预测结直肠癌转移的潜在生物学指标。

[关键词] 结直肠肿瘤;GTP结合蛋白质调节剂;基因，ras;肿瘤转移;预后

[中图分类号] R735.34

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）06-0841-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.168

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210909.1512.002.html;2021-09-09 18：15：02

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF G-PROTEIN SIGNALING MODULATOR 1 IN COLORECTAL CANCER

CHEN Yang， RAN Wenwen， WANG Lu， SONG Yaolin， LI Guangqi， XING Xiaoming

（Department of Pathology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression and significance of G-protein signaling modulator 1 （GPSM1） in colorectal cancer （CRC）.

Methods Paraffin-embedded tumor specimens and clinicopathological data were collected from 150 patients with primary CRC who were admitted to The Affiliated Hospital of Qingdao University from April 2015 to April 2016. Immunohistochemistry was usedto measure the expression of GPSM1 in CRC tissue and adjacent tissue， and quantitative real-time PCR was used to measure KRAS and NRAS mutations in paraffin-embedded tumor specimens. The association of GPSM1 expression in CRC tissue with clinicopathological features and prognosis was analyzed.

Results The expression level of GPSM1 in CRC tissue was significantly higher than that in the corresponding adjacent tissue （χ2=102.938，P<0.001）. The high expression of GPSM1 in CRC tissue was significantly associated with lymph node metastasis （χ2=5.429，P=0.020） and KRAS mutation （χ2=4.030，P=0.045）. The survival analysis showed that compared with the low GPSM1 expression group， the high GPSM1 expression group had significantly shorter disease-free survival time and overall survival time （P=0.046，0.036）.

Conclusion GPSM is highly expressed in CRC tissue， which might be associated with the poor prognosis of CRC patients， and GPSM1 may be used as a potential biological marker for predicting the metastasis of CRC.

[KEY WORDS]colorectal neoplasms; GTP-binding protein regulators; genes， ras; neoplasm metastasis; prognosis

结直肠癌（CRC）是胃肠道常见的恶性肿瘤之一，是全球范围内的第四大恶性肿瘤[1]。CRC起病隐匿，侵袭转移能力强，晚期转移是多数病人死亡的主要原因，但其转移的分子机制目前尚不明确[2]。G蛋白信号调节蛋白1（GPSM1）为G蛋白信号激活蛋白家族Ⅱ（AGSⅡ）的成员，是1999年由英国科学家在对酵母进行遗传学筛查时发现的一种蛋白质，该蛋白由N末端的7个四肽重复序列（TPR）和C末端的4个G蛋白调节模体（GPR）组成[3-4]。GPSM1在神经组织、睾丸组织中广泛分布，作为鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂参与G蛋白信号通路的调节，以及神经元分化和纺锤体形成等多种生物学进程[3-8]。近年来研究显示，GPSM1在人食管鳞状细胞癌、前列腺癌组织中异常表达并影响肿瘤细胞的增殖、转移及凋亡[9-10]。GPSM1也参与CRC细胞系HT29巨自噬的早期调控[11]，但GPSM1在CRC中的表达及作用尚不明确。大鼠肉瘤病毒（RAS）

基因突变是癌症最易发生的突变之一，约42%的CRC病人伴RAS基因突变[12]。RAS基因属于原癌基因家族，编码KRAS、NRAS和HRAS，其中KRAS突变率最高（约占85%）[13]。RAS基因突变可使细胞信号传导异常激活，持续传递有丝分裂信号，诱导细胞增殖分化，促进肿瘤发生[14]。美国肿瘤联合会（AJCC）第8版癌症分期系统明确指出，KRAS和NRAS是影响CRC预后的关键因素[15]。本研究旨在通过检测GPSM1在CRC组织中的表达，探讨GPSM1表达与KRAS、NRAS突变及病人临床病理特征的相关性，以期为CRC防治提供新的分子标志物及治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年4月—2016年4月青岛大学附属医院收治的150例CRC病人的石蜡组织样本及临床病理资料，临床病理资料包括病人性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、KRAS和NRAS突变情况等。所有病人均为原发性CRC，术前未行放化疗和靶向治疗。对150例CRC病人定期进行电话和门诊随访，随访截止日期为2020年3月。150例病人均有完整的随访资料，其中52例病人死亡，9例病人发生了术后转移复发。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 组织芯片制备 由兩名病理医师对所有蜡块进行复片，光学显微镜下选取典型区域并标记，使用Pathology Devices TMAjrTM组织芯片点样仪制作孔径为2.0 mm的组织芯片，4 μm切片。

1.2.2 GPSM1免疫组织化学检测 采用PV-6000法进行免疫组织化学染色。组织芯片经脱蜡、水化后，使用体积分数0.03的过氧化氢灭活内源性过氧化物酶10 min，高压修复2 min（枸橼酸盐pH值6.0）;滴加GPSM1一抗（1∶200，NBP1-91968，NOVUS，美国），以PBS代替一抗作为阴性对照，4 ℃孵育过夜;滴加通用型二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），37 ℃孵育30 min;DAB显色3 min，使用苏木精复染，脱水、封片。

每张切片由两名资深病理医师随机选择5个高倍视野，判读GPSM1染色结果。GPSM1阳性染色定位于细胞浆。根据染色强度及阳性细胞率进行半定量评分。染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性细胞率评分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51～75%为3分，>75%为4分。两项评分相乘，≥4分为高表达，<4分为低表达[16]。

1.2.3 KRAS及NRAS基因突变的检测 使用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒（TIANGEN公司，DP331-02，中国）提取150例CRC石蜡组织切片中的DNA，然后应用KRAS、NRAS突变检测试剂盒（上海源奇生物制药有限公司）检测其突变情况。使用ABI7500实时荧光定量PCR系统（Thermo Fisher Scientific Inc，美国）进行扩增。KRAS基因突变扩增程序为：42 ℃、5 min;94 ℃、3 min;94 ℃、15 s，60 ℃、60 s;共40个循环;于60 ℃下采集荧光信号。NRAS基因突变扩增程序为：42 ℃、 5 min;94 ℃、3 min;94 ℃、 45 s，60 ℃、80 s;共40个循环;于60 ℃下采集荧光信号。

1.3 统计学分析

使用SPSS 23.0软件对数据进行统计学处理。GPSM1表达与KRAS、NRAS突变及临床病理特征的关系分析采用Pearson χ2检验;GPSM1表达与病人术后生存时间的关系分析采用Kaplan-Meier生存分析和Log rank检验，生存曲线的绘制采用GraphPad Prism 7软件。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GPSM1在CRC组织中的表达

免疫组织化学检测结果显示，GPSM1在CRC组织细胞浆中呈高表达，在癌旁组织细胞浆呈低表达或不表达（图1）。在CRC组织中，108例呈高表达，42例呈低表达;在癌旁组织中，21例呈高表达，129例呈低表达。GPSM1在CRC组织与癌旁组织中的表达差异具有统计学意义（χ2=102.938， P<0.001）。

2.2 KRAS及NRAS基因突变情况

实时荧光定量PCR检测结果显示，CRC组织KRAS及NRAS突变率分别为44.00%（66/150）和3.33%（5/150）。

2.3 GPSM1表达水平与CRC病人临床病理特征的关系

GPSM1在CRC组织中的高表达与淋巴结转移（χ2=5.429，P=0.020）以及KRAS突变（χ2=4.030，P=0.045）相关，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、浸润深度、远处转移、NRAS突变等均无相关性（P>0.05）。见表1。

2.4 GPSM1表達与CRC病人预后的关系

根据GPSM1在CRC组织中的表达水平将CRC病人分为GPSM1高表达和低表达组，Kaplan Meier生存分析显示，GPSM1高表达组（n=108）CRC病人的无病和总体生存期较GPSM1低表达组（n=42）明显缩短（P=0.046、0.036）。见图2。

3 讨论

GPSM1是调节G蛋白信号转导系统的重要蛋白之一，生理状态下其主要作用是介导G蛋白信号转导通路的调控，参与神经元分化以及纺锤体形

成[3-5]。近年的研究发现，GPSM1在多种肿瘤组织

中异常表达，包括人食管鳞状细胞癌、胃癌、前列腺癌等，并且与肿瘤恶性程度及细胞增殖和侵袭性相关[9-10，17]。但GPSM1在CRC组织中的表达及意义尚缺乏相关研究。本研究通过免疫组织化学染色检测显示，GPSM1在CRC组织中的表达水平较其在癌旁组织明显升高，且是CRC病人预后不良的指标，提示GPSM1可能参与了CRC的发生发展。

目前研究表明，GPSM1与多种肿瘤的发生密切相关。SHI等[9]研究显示，食管鳞状细胞癌组织中GPSM1的低表达状态与肿瘤的分级呈正相关，GPSM1高表达的病人生存时间更长，GPSM1是食管鳞状细胞癌病人独立的预后因素;并且过表达GPSM1能够明显抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖。ZHANG等[17]研究证实，GPSM1的DNA甲基化可能参与胃癌的侵袭和转移，并且与癌症病人的预后显著相关。ADEKOYA等[10]的研究结果表明，GPSM1在前列腺癌中表达水平明显增高，前列腺癌细胞中过表达GPSM1可促进体内、体外肿瘤细胞的增殖。本研究对CRC组织中GPSM1表达与病人临床病理特征的相关性进行分析，结果显示，CRC组织高表达GPSM1的病人更容易发生淋巴结转移，而GPSM1表达与病人年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度等均无关。进一步分析GPSM1表达与CRC病人预后关系显示，GPSM1高表达病人预后较差，提示GPSM1可能参与了CRC的侵袭转移，是CRC预后不良的预测指标。

目前，GPSM1在CRC中作用的分子机制及相关信号转导通路尚未阐明。研究表明，Notch信号通路参与了CRC的上皮间质转化过程并调控肿瘤干细胞的形成，可促进CRC转移以及肿瘤形成[18]。Wnt/β-catenin信号通路在肠隐窝底部激活、结直肠稳态维持及肿瘤形成过程中均发挥至关重要的作用[19]。另外，核因子κB（NF-κB）、表皮生长因子受体（EGFR）、RAS等信号通路在调控CRC细胞凋亡、增殖、转移方面均发挥重要作用[20-22]。

KRAS突变是常见的致癌性突变，以12、13位密码子突变最为多见。突变型KRAS能够摆脱上游信号分子EGFR的调控，促进RAS-RAF-MEF-ERK信号通路的激活，增强肿瘤细胞对机体的适应性，促进肿瘤发生发展[23-24]。多项研究结果显示，KRAS突变与CRC转移显著相关，是CRC转移的潜在生物标志物[25-26]。本研究结果显示，CRC组织中GPSM1表达水平与KRAS突变显著相关。表明GPSM1可能与KRAS协同作用，促进CRC的发生与演进，或可作为临床检测CRC转移的补充指标。KRAS突变可影响下游信号通路传导，使肿瘤细胞对西妥昔单抗产生耐药，且KRAS与GPSM1

均可调控鸟嘌呤核苷酸的水解与结合，二者在功能上具有相似性[27-29]。这提示GPSM1可能与KRAS一同在西妥昔单抗的耐药机制中发挥作用，或可成为西妥昔单抗耐药的潜在指标。

综上所述，GPSM1在CRC中呈高表达状态，与CRC病人淋巴结转移及KRAS突变存在相关性，并与不良预后相关，可作为CRC诊断、治疗及预后判断的潜在指标。

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（本文編辑 马伟平）