口腔鳞状细胞癌RARRES2表达和中性粒细胞浸润与预后关系

胡小媛 冯元勇 杨茜 高菲 王宁 项锋钢

[摘要] 目的 探討口腔鳞状细胞癌（OSCC）组织视黄酸受体反应蛋白（RARRES2）的表达及其与中性粒细胞浸润密度的关系，并分析其与临床病理特征及预后的关系。

方法 应用免疫组织化学方法，检测74例OSCC组织标本及其对应的癌旁正常组织中RARRES2表达和中性粒细胞浸润情况，Spearman相关分析RARRES2表达和中性粒细胞密度之间的关系，Transwell实验检测RARRES2对中性粒细胞趋化能力的影响。应用Mann-Whitney检验分析RARRES2表达和中性粒细胞密度与临床病理因素的关系，Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行生存分析，Cox回归模型分析影响OSCC生存的危险因素。

结果 免疫组织化学检测结果显示，OSCC组织RARRES2表达显著高于癌旁组织（Z=-6.091，P<0.01），RARRES2高表达的OSCC组织区域中性粒细胞浸润的密度高于RARRES2相对低表达的癌组织区域（U=433.5，P<0.05）。Transwell结果显示，重组RAREES2对中性粒细胞样细胞有明显趋化作用。Spearman相关分析显示，RARRES2的表达和中性粒细胞浸润呈正相关（r=0.309，P<0.05）。Mann-Whitney分析显示，OSCC组织RARRES2高表达且中性粒细胞高密度与淋巴结转移（Z=-4.789，P<0.01）、TNM分期（Z=-4.293，P<0.01）和肿瘤复发（Z=-2.578，P<0.01）相关。生存分析显示，RARRES2高表达且中性粒细胞高密度的OSCC病人术后总体生存时间和无病生存时间更短（P=0.001～0.017）。Cox多因素回归分析表明，RARRES2高表达且中性粒细胞高密度是影响OSCC病人术后总体生存时间和无病生存时间的独立预后因素（P=0.031、0.003）。

结论 RARRES2高表达且中性粒细胞高密度提示OSCC病人预后不良，二者可作为判断OSCC病人预后的潜在指标。OSCC组织中RARRES2高表达可以趋化更多中性粒细胞浸润。

[关键词] 视黄酸受体反应蛋白;中性白细胞;头颈部鳞状细胞癌;预后

[中图分类号] R365;R739.91

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）06-0831-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.200

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211230.1017.004.html;2021-12-30 14：22：45

CORRELATION BETWEEN RARRES2 EXPRESSION AND NEUTROPHIL INFILTRATION IN ORAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA AND THEIR RELATIONSHIP WITH PROGNOSIS

HU Xiaoyuan， FENG Yuanyong， YANG Qian， GAO Fei， WANG Ning， XIANG Fenggang

（Department of Pathology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]Objective＼To explore the correlation between the expression of retinoic acid receptor responder protein （RARRES2） and neutrophil infiltration density in oral squamous cell carcinoma （OSCC） tissue， and to analyze their relationship with the clinicopathological characteristics and prognosis.

Methods Immunohistochemical methods were used to determine RARRES2 expression and neutrophil infiltration in 74 OSCC tissue specimens and their corresponding normal paracancerous tissues， Spearman correlation analysis was used to assess the relationship between RARRES2 expression and neutrophil density， and Transwell assay was used to determine the effect of RARRES2 on the chemotaxis of neutrophils. Mann-Whitney test was used to analyze the relationship of RARRES2 expression and neutrophil density with clinicopathological factors， the Kaplan-Meier method and Log-rank test were used for survival analysis， and the Cox regression model was used to analyze the risk factors affecting OSCC survival.

Results The immunohistochemical assay showed that the RARRES2 expression in the OSCC tissues was significantly higher than that in the paracancerous tissues （Z=-6.091，P<0.01） and the neutrophil infiltration density in the OSCC tissues with high RARRES2 expression was higher than that in cancerous tissues with relatively low RARRES2 expression （U=433.5，P<0.05）. Transwell results showed that recombinant RAREES2 had a significant chemotactic effect on neutrophil-like cells. Spearman correlation analysis showed that RARRES2 expression was positively correlated with neutrophil infiltration （r=0.309，P<0.05）. Mann-Whitney analysis showed that high RARRES2 expression and high neutrophil density were correlated with lymph node metastasis （Z=-4.789，P<0.01）， TNM staging （Z=-4.293，P<0.01）， and tumor recurrence （Z=-2.578，P<0.01）.

The survival analysis showed that OSCC patients with high RARRES2 expression and high neutrophil density had significantlyshorter over-all survival time and disease-free survival time after surgery （P=0.001 to 0.017）; the Cox multivariate regression analysis showed that high RARRES2 expression and high neutrophil density were independent prognostic factors influencing the overall survival time and disease-free survival time of OSCC patients after surgery （P=0.031，0.003）.

Conclusion High RARRES2 expression and high neutrophil density indicate a poor prognosis of OSCC patients， both of which can be used as potential indicators for the prognosis of OSCC patients. High RARRES2 expression in the OSCC tissues can result in chemotaxis of increased neutrophil infiltration.

[KEY WORDS]retinoic acid receptor reactive protein; neutrophils; squamous cell carcinoma of head and neck; prognosis

头颈部癌症是全球第八大常见癌症，该病病人的5年生存率为50%～60%[1-2]。口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部较常见的恶性肿瘤之一，其发生和发展的确切分子机制尚不明确。寻找影响其发生、发展及预后的肿瘤标志物对OSCC靶向治疗及预后有重要意义。肿瘤微环境中除包含癌细胞外，还包括免疫系统的细胞如中性粒细胞、巨噬细胞等[3]。最近的研究表明，中性粒细胞作为肿瘤微环境中的一个关键因子，在肿瘤的进展过程中起重要的调节作用[4]。视黄酸受体反应蛋白（RARRES2）也称为chemerin，是趋化因子样受体CMKLR1的配体[5]。RARRES2可以通过招募表达CMKLR1的免疫细胞趋化到淋巴器官和组织损伤部位，从而在免疫反应中起重要作用[5-7]，因此RARRES2可能在肿瘤免疫监视中起重要作用。WEIGERT等[8]研究发现，肠道炎症病人血清中的RARRES2水平较健康对照组高，RARRES2在肠道炎症中具有潜在的调节功能。还有研究显示，RARRES2是非小细胞肺癌（NCLC）的生物标志物，它在肺癌相关慢性炎癥到癌变过程中起着关键作用[9]。既往研究表明，RARRES2在OSCC高表达[10]，OSCC组织中性粒细胞浸润增加[11]，这两个因素都与OSCC病人临床预后不良有关[10-11]。然而，关于RARRES2对肿瘤中性粒细胞浸润影响的报道较少。本研究检测OSCC组织中RARRES2的表达水平和中性粒细胞浸润的密度，探讨二者与OSCC病人临床病理特征及生存预后的关系。

1 材料与方法

1.1 标本收集

收集青岛大学附属医院口腔颌面外科2005—2010年手术切除的74例OSCC癌组织及其对应的癌旁相对正常组织标本。病人男51例，女23例，年龄32～86岁，平均（60.4±11.1）岁。所有病人均未接受化疗、放疗等抗肿瘤治疗。所有手术切除标本经40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，用于免疫组织化学检测。由两位经验丰富的病理医师确诊为OSCC。所有病人临床病理资料完整。该研究得到了青岛大学附属医院伦理委员会的批准，并且符合赫尔辛基宣言要求。

1.2 主要试剂

人早幼粒血细胞（HL-60细胞）购于中国科学院。RPMI-1640 培养基和胎牛血清（Gibco公司）;重组人RARRES2抗体、RARRES2抗体（Abcam公司，美国）;全反式视黄酸（Sigma公司，美国）;CD15阳性抗体、Polymer免疫组织化学双染检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 免疫组织化学双染色及结果判定

全部组织标本石蜡包埋，55 ℃阵列融合，4 μm厚连续切片，苏木精-伊红（HE）染色，复检。使用Po-lymer双染检测试剂盒进行染色：组织切片经脱蜡和梯度乙醇水化后，加体积分数0.03的H 2O 2灭活内源酶;在95 ℃ EDTA缓冲液中加热修复抗原，自然冷却，水洗，加入RARRES2、CD15阳性混合一抗4 ℃孵育过夜;磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，加入二抗山羊抗兔抗体 37 ℃孵育30 min;PBS 冲洗后进行DAB 显色和GBI显色，苏木精复染，中性树胶封片。 由两位经验丰富的病理医师在光镜下双盲阅片并判定结果。

免疫组织化学结果判定参照相关文献标准[11]：在400倍光镜下观察，细胞质染色呈红色或粉红色为RARRES2阳性表达，中性粒细胞CD15阳性染色呈棕黄色或棕褐色。①RARRES2染色强度评分：0分，无着色（-）;1分，轻度染色（+）;2分，中度染色（）;3分，重度染色（）。阳性细胞占比计分：0分（<5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（>75%）。免疫组织化学染色总分=染色强度得分+阳性细胞占比得分，总分<4分为低表达，≥4分为高表达。②CD15阳性中性粒细胞密度计算：在标本组织区域（直径1 mm）中计数血管外CD15阳性中性粒细胞的数量，重复3次，计算每例标本的中性粒细胞数量平均值，最后算出74例OSCC组织的中性粒细胞数量的中位数。如果标本的平均数大于中位数，则为中性粒细胞高密度，否则为低密度。根据RARRES2表达和CD15阳性中性粒细胞密度，将组织标本分为3组：RARRES2低表达且CD15阳性中性粒细胞低密度组（#1），RARRES2低表达且CD15阳性中性粒细胞高密度组或RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞低密度组（#2），RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞高密度组（#3）。

1.4 中性粒细胞样细胞（dHL-60细胞）的培养以及分化

HL-60细胞用含体积分数0.10胎牛血清高糖RPMI-1640培养基，置37 ℃、含体积分数0.05 CO 2 的细胞培养箱培养，应用1 μmol/ L全反式视黄酸诱导3 d，使HL-60细胞分化为dHL-60细胞。

1.5 Transwell实验检测细胞的趋化能力

将2×105个dHL-60细胞悬液接种在Transwell小室上室，以200 μL无血清培养基培养，下室为含有体积分数0.15胎牛血清和不同浓度重组人RARRES2（20、50、100 μg/L）的培养基600 μL，对照组下室为含有体积分数0.15胎牛血清的培养基。37 ℃孵育10 h后，使用细胞计数板对下室中的dHL-60细胞进行计数，计算趋化指数。趋化指数=实验组的dHL-60细胞数/对照组的dHL-60细胞数×100%。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。计数资料以例数和百分比表示，数据间比较采用Wilcoxon秩和检验和Mann-Whitney检验。应用Spear-man相关分析RARRES2表达和CD15阳性中性粒细胞密度之间的关系，Mann-Whitney检验分析RARRES2表达和CD15阳性中性粒细胞密度与临床病理因素的关系，Kaplan-Meier 法和Log-rank检验分析病人的生存时间和生存率，Cox回归模型分析影响生存的危险因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OSCC组织CD15阳性中性粒细胞浸润密度和RARRES2表达与临床病理参数的关系

免疫组织化学双染检测显示，OSCC组织中RARRES2高表达49例（66.22%），RARRES2低表达25例（33.78%）;而癌旁正常组织中RARRES2高表达10例（13.51%），RARRES2低表达64例（86.49%）。在所有OSCC组织和癌旁正常组织样本中，血管外CD15阳性中性粒细胞的数量为1～968个，中位数为59.5;OSCC组织中高密度组38例（51.35%），低密度组36例（48.65%）;癌旁正常组织中高密度组11例（14.86%），低密度组63例（85.14%）。OSCC组织RARRES2表达显著高于癌旁组织（Z=-6.091，P<0.01）;RARRES2高表达的OSCC组织区域CD15阳性中性粒细胞浸润密度高于RARRES2相对低表达的癌组织区域（U=433.5，P<0.05）;OSCC组织RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞高密度与淋巴结转移（Z=-4.789，P<0.01）、TNM分期（Z=-4.293，P<0.01）和肿瘤复发（Z=-2.578，P<0.01）相关。Spearman相關分析表明，RARRES2表达与CD15阳性中性粒细胞的浸润呈正相关（r=0.309，P<0.05）。见图1和表1、2。

2.2 RARRES2表达和CD15阳性中性粒细胞浸润与OSCC病人术后生存的关系

Kaplan-Meier分析表明，#1组、#2组、#3组平均总体生存时间分别为83.30、77.82和58.40个月，平均无病生存时间分别为83.30、76.38和46.66个月，#3组的总体和无病生存时间短于#1组、#2组（P=0.001～0.017），#2组的总体和无病生存时间与#1组相比较差异无统计学意义（P=0.474、0.382）。在TNM分期为Ⅲ/Ⅳ期病人中，#1组、#2组、#3组平均总体生存时间分别为73.12、66.50和54.65个月，平均无病生存时间分别为76.12、50.60和20.25个月，#3组的平均无病生存时间较#1组、#2组短（P=0.045、0.048），#2组的总体和无病生存时间与#1组相比较差异无显著意义（P=0.135）。见图2。

2.3 OSCC病人的独立预后因素

Cox模型单因素分析结果显示，影响OSCC病人总体和无病生存时间的因素有临床分期（P=0.007、0.002）、RARRES2表达水平和CD15阳性中性粒细胞密度（表达和密度）（P=0.004、0.002）、淋巴结转移（P=0.012、0.003）。将单因素分析显示对生存预后有影响的因素纳入多因素分析，结果显示，RARRES2表达水平和CD15阳性中性粒细胞密度（P=0.031、0.003）是影响OSCC病人总体和无病生存时间的独立预后因素。见表3、4。

2.4 RARRES2对dHL-60细胞趋化的影响

Transwell实验结果显示，0、20、50、100 μg/L RARRES2各组趋化指数分别为1.03、2.52、4.02、5.59，表明RARRES2可以浓度依赖性地趋化dHL-60细胞，差异具有统计学意义（F=335.994，P<0.001）。

3 讨论

中性粒细胞参与机体的固有免疫应答，为人體的第一道免疫防线。越来越多的证据表明，肿瘤相关的中性粒细胞（TANs）在肿瘤微环境中发挥重要作用，可通过合成和分泌相关细胞因子促进肿瘤的发生、发展和转移[12]。RARRES2是一种新型的多功能脂肪因子，它在调节炎症、脂肪代谢、血管生成、细胞增殖迁移和趋化作用中起着重要作用[13-16]。大量研究表明，RARRES2与肿瘤的发生发展有关，并可以用作肿瘤诊断的生物标志物[17]。ERDOGAN等[18]研究显示，结直肠癌病人的RARRES2表达明显高于健康对照组，认为其可作为结直肠癌诊断和预后生物标志物。WANG等[19]研究显示，高水平的循环RARRES2与胃癌侵袭性增加有关。然而，关于肿瘤中RARRES2的表达与中性粒细胞浸润关系的研究报道较少。

本研究探讨OSCC组织中RARRES2表达和中性粒细胞浸润的相关性，并分析其与临床病理特征及预后的关系。结果显示，RARRES2高表达区域中性粒细胞浸润增多，RARRES2表达与CD15阳性中性粒细胞密度呈正相关。提示OSCC组织RARRES2高表达可能与中性粒细胞的浸润有关。为了探讨OSCC组织中RARRES2表达对中性粒细胞浸润影响机制，本研究应用Transwell小室和HL-60细胞检测了RARRES2对中性粒细胞的趋化作用。由于人中性粒细胞的寿命较短，很难在体外培养这些细胞。为了建立稳定可靠的细胞模型，本研究选择了HL-60细胞株。该细胞系已被确定为研究炎症和癌症中性粒细胞活性和调节的模型[20-22]。本文结果显示，重组RARRES2可以浓度依赖性地趋化dHL-60细胞。有研究表明，极化的中性粒细胞还可以通过产生促血管生成分子碱性成纤维细胞生长因子2来促进小鼠胃肠道癌肝转移模型中的血管生成和肝转移性肿瘤生长[23-24]。本研究结果还显示，OSCC组织RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞高密度与淋巴结转移、TNM分期和肿瘤复发有关，而与性别、年龄、病理分级、肿瘤大小无关，说明在淋巴结转移、TNM分期高和肿瘤复发的病人中RARRES2的表达水平更高、中性粒细胞浸润更多。提示RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞高密度可能与OSCC的进展密切相关。本研究Kaplan-Meier分析显示，RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞高密度OSCC病人的术后生存时间更短。此外，在TNM分期为Ⅲ/Ⅳ期的OSCC病人中，RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞高密度组的无病生存时间更短;Cox多因素回归分析显示，RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞高密度是影响OSCC病人术后总体生存时间和无病生存时间的独立预后因素。以上结果表明，RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞高密度与OSCC病人预后差密切相关，RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞高密度可能成为评价OSCC预后不良的一种有效指标。

综上所述，OSCC组织中RARRES2高表达且CD15阳性中性粒细胞高密度均与OSCC病人不良的临床预后有关。RARRES2可能通过吸引更多的CD15阳性中性粒细胞到达OSCC肿瘤部位来促进OSCC的演进和发展。

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（本文編辑 黄建乡）