活性氧刺激响应纳米载体

周 雯, 杨开广, 赵宝锋, 张丽华, 张玉奎

(1. 中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析化学重点实验室,辽宁 大连 116023; 2. 中国科学院大学,北京 100049)

功能材料近年来发展蓬勃,而且应用领域广泛。相小超等[1]总结了应用于蛋白质组研究的功能材料,如磁性纳米材料、金属有机骨架材料等,该类功能材料能够克服传统蛋白质组学方法灵敏度低、准确性差等缺点。除此之外,它在生物医药领域、功能材料中也有着广泛的研究。

ROS响应纳米载体的核心是其骨架聚合物上的ROS响应基团(又称为ROS响应连接子),响应基团对ROS响应,使得聚合物链段发生断裂或者极性变化,进而调控纳米载体释放药物。如表1所示,响应基团可以根据元素的种类,划分为硫族元素类响应基团和其他元素类响应基团。硫族元素类响应基团主要包括硫醚、缩硫酮、硒化物、二硒化物、碲化物,其他元素类响应基团主要包括芳香硼酸酯、过氧草酸酯、二茂铁。

1 硫族元素类ROS响应载体

硫醚和缩硫酮都属于硫元素的连接子,但各自的响应机理存在差异。硫醚的响应机理是ROS引起聚合物链段疏水-亲水相变,从而释放药物;而缩硫酮的响应机理是ROS引起聚合物链段断裂,进而释放药物。Cheng等[5]使用疏水的苯硫醚基团(PhS)修饰介孔二氧化硅(MSNs)的纳米孔,在ROS响应下,疏水的苯硫醚被氧化成亲水的苯亚砜或苯砜,从而使纳米孔被润湿,导致内部药物的释放;在其研究中,装载罗丹明6G的纳米颗粒MSNs-PhS (1∶20)在100 μmol/L H2O2中10 h约释放25%;在ROS过表达的MCF-7细胞中明显观察到胞内ROS促使纳米颗粒内部阿霉素释放,而正常HUVEC细胞中只观察到极少量的阿霉素释放。

近几年来,硫族元素中缩硫酮是研究最为广泛的ROS响应载体材料之一。Li等[6]利用缩硫酮、美国食品药品监督管理局批准的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和聚乙二醇(PEG),以及靶向肽(RGD),合成了聚合物RGD-PEG-TK-PLGA,RGD靶向肿瘤细胞表面的整合素avβ3,在细胞内ROS刺激下,缩硫酮发生断裂进而使得载体材料释放药物;装载阿霉素的NPs在100 μmol/L KO2环境下,6h约释放58%;对于Cal27细胞,修饰RGD的纳米颗粒的细胞摄取量是未修饰的纳米颗粒的3倍,说明RGD肿瘤靶向性提高了细胞摄取量;小鼠活体实验表明:纳米颗粒(NPs)降低了药物阿霉素的毒性,增加了肿瘤积累,混合装载能刺激细胞产生ROS的α-维生素E琥珀酸酯,能够加速缩硫酮断裂释放阿霉素,并且进一步提高其抗肿瘤效果。为了实现协同治疗肿瘤,Chen等[7]将缩硫酮引入聚氨基酯骨架中,进一步在载体表面覆盖亲水的藻酸双酯钠,并同时装载光敏剂(IR780)和阿霉素,构建出纳米颗粒PPID;在808 nm激光照射下,IR780引起细胞内温度上升以及ROS大量产生,在ROS响应下,缩硫酮断裂释放阿霉素,实现了光热疗法、光动力疗法、化学疗法的组合;在100 μmol/L H2O2下,PPID纳米颗粒在20 h释放约40%阿霉素;在Hep1-6细胞中,没有激光照射下,PPID纳米颗粒的半抑制浓度(50% inhibiting concentration,IC50)为0.72 μg/mL阿霉素;在808 nm激光照射下,结合光热疗法、光动力疗法、化疗,肿瘤细胞杀伤效果尤为显著,对于肿瘤治疗具有良好的应用前景。

表 1 ROS响应基团的机理

有研究[8,9]表明,线粒体功能紊乱与癌症、神经性疾病等多种疾病有牵连。为了同时解决药物的ROS响应释放和线粒体靶向问题,Zhang等[10]直接将缩硫酮与药物喜树碱共价连接,利用靶向肽(cRGD)和三苯基磷(TPP),结合聚二甲基丙烯酰胺,合成了肿瘤细胞和线粒体双重靶向的纳米反应器DT-PNs,实现了肿瘤组织、亚细胞器ROS响应的靶向释放;将细胞靶向的共聚物和线粒体靶向的共聚物共混自组装,cRGD靶向肿瘤细胞表面的整合素avβ3,TPP靶向线粒体外膜,在线粒体ROS存在下,缩硫酮断裂释放喜树碱,喜树碱引起线粒体ROS产生,促进喜树碱释放,实现自循环;在100 μmol/L H2O2中80 h释放28%喜树碱;进行肿瘤小鼠实验,DT-PNs明显抑制小鼠肿瘤生长,展现了极好的肿瘤治疗效果。该研究实现了药物的双重靶向和ROS响应释放,在肿瘤细胞线粒体特异性释放喜树碱,并自循环实现ROS爆发和喜树碱大量释放,对于杀伤肿瘤具有良好的效果。

对于硫醚和缩硫酮的ROS敏感性差异,Xu等[11]利用硫醚、缩硫酮合成了3种两亲性嵌段共聚物(只含硫醚、只含缩硫酮、同时含硫醚和缩硫酮),比较了3种载体的ROS响应释放情况以及抗肿瘤效果;其中装载阿霉素的只含硫醚的纳米颗粒在500 μmol/L H2O2中展现出最快的ROS响应释放(72 h释放约65%),对于HeLa细胞和4T1细胞也呈现出最强的肿瘤杀伤效果(IC50分别为0.46和1.29 μg/mL),是很有前景的ROS响应载体。

跟硫同族的硒和碲,在ROS响应方面也引起了关注。硒化物和碲化物性质相似,都是在ROS响应下,疏水的硒化物/碲化物转变成亲水的亚砜/砜,聚合物相变引起内部药物释放;而二硒化物连接子的性质略微独特,具有氧化还原双重响应,氧化环境下二硒键断裂形成硒酸,还原环境下二硒键形成硒醇,断裂引起内部药物的释放。Ma等[12]将硒化物引入疏水的聚氨酯嵌段,搭配PEG合成两亲性嵌段共聚物PEG-PUSe-PEG,在ROS响应下,硒化物的疏水-亲水相变使载体发生膨胀、崩解,释放出内部装载的阿霉素;在0.1% H2O2下10 h释放72%阿霉素,响应释放效果明显优于嵌段共聚物PEG-PUS-PEG(10 h释放41%),初步推测可能是因为元素硒和硫的氧化敏感性差异导致的。该团队[13]对此聚合物结构进行了持续并深入的探索,继续引入二硒化物形成嵌段共聚物PEG-PUSeSe-PEG,在0.01% H2O2或0.01 mg/mL谷胱甘肽(GSH)中都观察到良好的响应以释放罗丹明B。Cao等[14]引入碲化物形成嵌段共聚物PEG-PUTe-PEG,ROS响应下发生碲化物的疏水-亲水相变,通过循环伏安法比较含硫、硒、碲的模型化合物的氧化峰,碲化物更低的氧化电位显示出它极好的氧化敏感性,能够对更低浓度的ROS响应,因此碲化物连接子被评价为超敏ROS响应材料。在之前工作的基础上,该团队[15]对该两亲性嵌段共聚物进行了改进,用β-硒化羰基代替α-硒化部分,合成了聚合物C6-C3Se-PEG2000,在ROS响应下,硒化物被氧化为硒亚砜,然后发生硒亚砜分子内消除反应,实现了氧化引起聚合物结构解聚;合成的C6-C3Se-PEG2000能对1 mmol/L H2O2氧化响应断裂,而超敏碲化物的类似结构正在探索,初步通过1H NMR能够观察到C6-C3Te能够对生理条件下(50、100 μmol/L)氧化环境进行响应。

二硒化物由于氧化还原双重响应的特性,能够对肿瘤细胞内的高含量ROS和GSH响应,快速进行药物释放。近年来关于二硒化物连接子的报道较多,Fan等[16]利用硒代胱胺、美国食品药品监督管理局批准的PLGA和PEG,合成了ROS响应的载体VPSeP,装载黄连素;在炎症部位,ROS引起二硒键断裂,释放黄连素,黄连素促进ROS生成,进一步激发载体裂解;在10 mmol/L H2O2中,30 h约释放80%黄连素;在关节炎小鼠实验中,它能够抑制炎症因子IL-1和IL-6的分泌,保护骨关节不被破坏,减轻爪水肿。除了将二硒键引入聚合物结构的研究,Shao等[17]直接将含二硒键的有机二氧化硅模块掺入介孔二氧化硅(MSN)中,通过静电相互作用装载核糖核酸酶A,进一步包裹HeLa细胞的膜碎片,成功合成了具有同源靶向性、氧化还原双重响应的纳米颗粒;此时,氧化还原响应更为灵敏的MSN2纳米颗粒在100 μmol/L H2O2中10 h约释放55%核糖核酸酶A,在5 mmol/L GSH中10 h约释放50%核糖核酸酶A;将纳米颗粒分别与HeLa细胞、MCF-7细胞共孵育,在HeLa细胞中观察到更高的荧光强度,说明了载体同源靶向性;在肿瘤小鼠实验中,也明显观察到了肿瘤生长抑制。

2 其他元素类ROS响应载体

芳香硼酸酯作为ROS响应连接子,能够被氧化成苯酚和硼酸,在ROS响应载体方面也获得了很大的关注。Broaders等[18]利用芳香硼酸酯作为连接子,合成了氧化敏感的纳米颗粒Oxi-DEX,即用芳香硼酸酯修饰右旋糖苷的羟基,使聚合物链段由水溶性转变为油溶性,进而实现模型抗原-鸡卵白蛋白(OVA)的包载;在H2O2环境下,芳香硼酸酯降解,暴露出右旋糖苷的羟基,最终使得聚合物链段转换为原始的水溶状态,即使聚合物链段发生极性变化,释放出OVA;在1 mmol/L H2O2下,2 h后Oxi-DEX发生完全的相变;装载OVA的Oxi-DEX明显引起DC2.4小鼠神经系统树突细胞的MHC Ⅰ抗原表达增强,该载体能够作为快速的选择性给药系统。另外,有报道表明,树突细胞的吞噬体内ROS浓度能够高达1 mmol/L[19],Oxi-DEX能够实现生理环境下的ROS响应,但是对于ROS浓度低至100 μmol/L的肿瘤细胞,它并不能实现响应。为了解决这一问题,De Gracia Lux等[20]利用芳香硼酸酯合成了两种聚合物,聚合物1是芳香硼酸酯直接连接主链,聚合物2是芳香硼酸酯通过苄基醚连接主链,聚合物1形成的载体1在1 mmol/L H2O2中26 h约释放50%尼罗红,而聚合物2却能在100 μmol/L H2O2中达到类似释放效果;将载体2装载荧光素二乙酸,与中性粒细胞孵育,佛波酯处理6 h后,通过荧光强度观察到释放增加了2倍,使得芳香硼酸酯纳米载体能够在肿瘤细胞生理环境下ROS响应释放。

Deng等[21]利用芳香硼酸酯形成了4种H2O2响应的单体,选择单体NBMA形成两亲性嵌段共聚物,利用线粒体靶向肽(CGKRK)进行表面功能化,合成了具有线粒体靶向、氧化响应的聚合物囊泡;在线粒体H2O2响应下,聚合物发生级联消除和脱羧反应,疏水性双分子层发生酰胺反应,导致聚合物囊泡内部交联,使得双分子层发生疏水-亲水相变,从而释放出疏水性双分子层封装的紫杉醇,以及水性内腔封装的盐酸阿霉素;载体Gd-N8在1 mmol/L H2O2中24 h约释放94%盐酸阿霉素和93%紫杉醇;将小分子细胞核染料(DAPI)和大分子的右旋糖苷共同封装在亲水内腔,与佛波酯处理后的HeLa细胞共孵育12 h,观察到大部分的蓝色荧光DAPI从囊泡扩散进入细胞核,而红色荧光的右旋糖苷与囊泡出现极好的共定位,说明氧化环境促使疏水性双分子层发生相变,小分子DAPI发生渗透,双分子层交联保持了囊泡结构的完整性,大尺寸的右旋糖苷被保留在囊泡内腔。该载体实现了两种物理性质不同的药物同时封装,并且通过ROS响应促使囊泡的双分子层发生相变,在保持了囊泡结构完整性的基础上,实现了药物的释放。

芳香硼酸酯形成的载体能够对生理相关的H2O2浓度响应,获得了较好的发展。而含二茂铁的聚合物是将金属引入聚合物,虽然由于优异的物理性质获得了关注,但是在ROS响应方面,仍需要进一步的发展。Na等[22]合成了一系列含二茂铁的两亲性嵌段共聚物FMMA-r-MA,在水中自组装形成内核疏水的纳米颗粒,氧化后疏水的二茂铁分子变成亲水的二茂铁阳离子,发生疏水-亲水相变,同时由于阳离子的静电排斥作用会让纳米颗粒膨胀破碎,释放内部的尼罗红,氧化响应和稳定性最好的FNP (C2)纳米颗粒在0.4 mol/L H2O2环境下,8 h约释放25%尼罗红。

与Li等[6]和Fan等[16]设计的结构类似,Liang等[23]使用过氧草酸酯连接PLGA和PEG,合成聚合物3s-PLGA-PO-PEG,装载模型抗原OVA,在ROS响应下,过氧草酸酯断裂释放OVA,使用聚醚酰亚胺修饰纳米颗粒表面以增加转染效率,从而构建出PPO纳米颗粒;PPO纳米颗粒在200 μmol/L H2O2中两天释放超过90%OVA;在小鼠活体实验中,PPO纳米颗粒能够引起OVA特异性抗体的生成,从而上调CD4+和CD8+T细胞的比例,激活记忆T细胞。这种携带抗原疫苗的NPs能够实现体内的免疫响应。

如表2所示,对于ROS刺激响应纳米载体,缩硫酮和芳香硼酸酯作为ROS响应基团,引入纳米载体较为广泛,而且ROS响应也较为灵敏,两者在细胞层面皆有良好的应用。二硒化物不仅是ROS响应基团,而且是GSH响应基团,对于ROS和GSH都呈现高含量的肿瘤细胞,二硒化物的双重响应能够促使药物的响应释放;但是由于细胞质内也呈现高浓度的GSH,对于亚细胞器的特定响应释放,二硒化物还呈现一定的劣势。结构和性质十分类似的硫醚、硒化物和碲化物中,目前硒化物和碲化物的ROS响应载体发展较少,可能是出于它们的生物层面安全性考虑,或者是载体制备的困难程度影响;但是由于碲化物的ROS超敏能力,它还具有较大的应用潜力。ROS响应基团中的过氧草酸酯和二茂铁在ROS响应方面还需要进一步的发展,以获得生理条件下的响应。

表 2 ROS刺激响应纳米载体的性能比较

表 2 (续)

3 总结

由于疾病部位的ROS水平异常,因此ROS响应纳米载体具有靶向给药、降低药物毒性等优点,具有广阔的应用前景和发展潜力。制备ROS响应纳米载体时,ROS响应基团的氧化敏感性值得考虑,本文中的硫醚、硒化物、碲化物、二茂铁都是ROS引起其疏水-亲水相变,进而引起药物释放,特别是对于硒化物,β-硒化羰基代替α-硒化部分后,硒化物被氧化为硒亚砜,会继续发生硒亚砜消除反应,引起聚合物断裂;缩硫酮、二硒化物、芳香硼酸酯、过氧草酸酯都是ROS引起其断裂进而释放。ROS响应纳米载体用于活体的研究才刚刚起步,载体的生物相容性、生物降解性尤其需要关注,只有在确保安全的前提下,ROS响应纳米载体才能起到对疾病部位进行智能释放药物、精准治疗的目的。