超声引导下注射肺表面活性物质预防早产兔肺损伤的实验研究

赖为柽 何韶铮 郑新颖 苏淇琛 吕国荣

早产儿由于肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS）合成不足，机体抗氧化系统未发育完善，常发生急性肺损伤，导致呼吸窘迫综合征等疾病，是早产儿死亡的主要原因之一［1］。本课题组前期研究［2］证实在羊膜腔内注射PS 可有效预防早产儿肺损伤，其原理是PS 通过胎儿宫内呼吸运动进入胎儿呼吸道，从而发挥作用。在此基础上，本实验旨在探讨将PS直接注入胎肺效果是否有更佳，以及该方法预防早产儿肺损伤的可行性和有效性。

材料与方法

一、实验动物

健康新西兰孕兔15 只，体质量4.0～5.0 kg，购于泉州医学高等专科学校实验动物中心，许可证号：SYXK（闽）2016-0001。

二、主要实验仪器

使用Supersonic Imagine Aixplorer 彩色多普勒超声诊断仪，线阵探头，频率4～15 MHz；FEI 公司透射电镜QUANTA 450。

三、实验方法

将孕兔随机分为胎肺注射PS组（胎肺组）、羊膜腔内注射PS组（羊膜腔组）及对照组，每组各5只（共15窝胎兔）。参照文献［2-3］于妊娠第27 d 剖宫产术前1 h行超声引导下穿刺（穿刺针22 G）：胎肺组每只胎兔肺内注射0.1 ml PS，羊膜腔组每只胎兔羊膜腔内注射0.1 ml PS（图1），对照组每只胎兔羊膜腔内注射0.1 ml生理盐水；注药后超声观察确认药物或生理盐水弥散。术后1 h行剖宫产取出早产兔。

图1 超声引导下注射PS示意图（箭头示穿刺针）

每窝随机选取2只早产兔记录存活时间。剖出早产兔30 min 后，每窝随机选取2 只行支气管肺泡灌洗测量二棕榈磷脂酰胆碱（DPPC）和白细胞介素-6（IL-6）含量。取早产兔左肺下叶，行HE 染色观察病理学改变，参照文献［4］行肺组织病理损伤评分。取右肺下叶，使用透射电镜观察Ⅱ型肺泡上皮细胞（AECⅡ）超微结构改变；取肺组织切片行免疫组化测量PS 相关蛋白-A（SP-A）表达水平并计算平均光密度，TUNEL 法检测其细胞凋亡并计算凋亡指数。

四、统计学处理

应用SPSS 23.0统计软件，计量资料以xˉ±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较行LSD法；肺组织病理损伤评分以中位数（四分位距）表示，组间比较行Kruskal-Wallis H 检验，两两比较行Nemenyi 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、各组一般情况、存活时间及实验室检查结果比较

各组早产兔均未见死胎和明显结构畸形，羊膜腔、胸腔及体表均未见出血等穿刺并发症。与对照组比较，胎肺组和羊膜腔组早产兔存活时间均明显延长，DPPC含量和SP-A表达水平均增加，肺组织细胞凋亡指数和IL-6 含量均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与羊膜腔组比较，胎肺组早产兔DPPC 含量、SP-A 表达水平及IL-6 含量均增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；两组存活时间和凋亡指数比较差异均无统计学意义。见表1。

表1 各组早产兔存活时间和实验室检查指标比较

表1 各组早产兔存活时间和实验室检查指标比较

与对照组比较，*P＜0.05；与羊膜腔组比较，#P＜0.05。DPPC：二棕榈磷脂酰胆碱；SP-A：肺表面活性物质相关蛋白-A；IL-6：白细胞介素-6

凋亡指数（%）11.26±4.32*15.61±3.90*27.56±7.00 20.63 0.000组别胎肺组羊膜腔组对照组F值P值存活时间（min）333.30±60.05*326.20±53.13*75.20±16.36 96.82 0.000 DPPC含量（μg/ml）93.96±17.53*#78.45±13.91*44.34±8.30 33.94 0.000 SP-A表达水平0.400±0.096*#0.280±0.070*0.140±0.047 18.48 0.000 IL-6含量（ρg/ml）31.47±5.13*#25.36±3.94*38.25±6.75 14.25 0.000

二、各组肺组织光镜下表现比较

对照组肺损伤病理评分为5.67（4.67，7.50）分；肺组织结构紊乱，肺泡部分萎缩，充气不均匀，肺泡隔较厚且厚薄不均，肺泡腔内多见水肿液、渗出物及红细胞。羊膜腔组肺损伤病理评分为2.25（1.67，3.04）分，胎肺组肺损伤病理评分为2.17（1.58，2.54）分，二者损伤程度均明显小于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。羊膜腔组与胎肺组镜下表现相似，肺泡结构基本完整，扩张较均匀，肺泡腔尚清晰，二者肺损伤病理评分比较差异无统计学意义。见图2。

三、各组AECⅡ透射电镜下表现比较

对照组板层小体数量显著减少，排空现象明显，内质网多见不规则扩张、肿胀；羊膜腔组与胎肺组电镜下表现相似，可见较丰富的板层小体，内质网肿胀少见。见图3。

图2 各组早产兔肺组织病理图（HE染色，×100）

图3 各组早产兔AECⅡ透射电镜下观（白色箭头示板层小体）

讨 论

早产儿由于出生过早，其PS含量不足且抗氧化应激系统未发育完善，易发生急性肺损伤，机制如下：①PS 含量不足导致肺不张、肺顺应性下降，气体交换受限，随后出现低氧血症和代谢性酸中毒，从而使肺血管痉挛、血管内皮受损，导致以IL-6 为主的细胞因子在炎症过程中的表达［2］；②在适应了胎儿期相对低氧的宫内环境后，新生儿出生后暴露于空气极易诱导大量活性氧自由基产生，而抗氧化系统尚不成熟的早产儿无法快速代谢过多的活性氧自由基，更易发生严重的氧化应激，直接影响细胞增殖、凋亡，继而引起细胞死亡和氧化损伤［5-6］。新西兰兔的肺发育过程与人类相似，在其总妊娠时间的85%～90%时行剖宫产可获得早产动物肺损伤模型［7］。

PS 是储存于AECⅡ板层小体中的脂蛋白混合物，通过胞吐方式释放并铺展于肺泡内面，起到降低肺泡表面张力、稳定肺泡大小的作用。脂质中含量最高的是磷脂酰胆碱，其活性状态DPPC 是PS 主要生理作用的活性成分。SP-A在蛋白质中表达量最丰富，是磷脂发挥功能的重要载体，具有抑制局部炎症介质、细胞因子的合成及释放、发挥免疫平衡的作用［8］。本实验通过测量DPPC 含量和SP-A 表达水平来反映早产兔肺中PS 含量，结果表明胎肺注射PS 和羊膜腔内注射PS 均可有效提高早产兔肺内DPPC 含量和SP-A 表达水平，降低肺损伤病理评分和凋亡指数，减少IL-6 含量的释放，延长早产兔存活时间。相对于羊膜腔组，胎肺组DPPC含量和SP-A 表达水平均更高（均P＜0.05），说明超声引导下宫内微创给药能将药物更精准地作用于目标脏器，从而提高药物的利用率。虽然本实验中胎肺组和羊膜腔组肺组织病理损伤评分和凋亡指数比较差异均无统计学意义，但与羊膜腔组比较，胎肺组病理损伤评分和凋亡指数均呈下降趋势。本实验模型为兔早产后30 min 的状态，时间较短，随着病程进展，肺中PS含量更高的胎肺组急性肺损伤程度是否较羊膜腔组向更好的方向发展尚有待今后进一步探究。

细胞凋亡是氧化应激相关肺损伤的一个重要组织学特点，研究［9-10］表明高氧诱导的细胞凋亡与肺损伤程度呈正相关。本实验中，相较于胎肺组和羊膜腔组，对照组早产兔AECⅡ板层小体数量显著减少，排空现象明显，这是一种代偿性表现，由于对照组早产兔肺PS 含量少，机体代偿性加速释放已合成的PS。对照组早产兔的AECⅡ内质网多出现不规则扩张、扭曲及肿胀，这是内质网应激的表现，长时间持续且严重的内质网应激会引发内质网相关性细胞凋亡。研究［9］证实内质网应激启动的凋亡途径参与早产儿高氧肺损伤并发挥主要作用，其机制与内质网蛋白57 和CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白表达增加有关。文献［11］报道PS 应用于早产儿不仅可通过改善肺通换气功能、预防肺泡塌陷发挥治疗作用，还可减轻机体氧化应激反应程度，改善病情及临床预后，本实验结果亦与之一致。另外，本实验中胎肺组IL-6含量高于羊膜腔组（P＜0.05），但两组早产兔均未见明显并发症，凋亡指数下降，胎肺组IL-6含量升高的原因可能是胎肺注射过程中对胎兔造成的应激刺激和穿刺损伤。IL-6是机体急性应激反应中最敏感的一种标志物，在受到疼痛刺激、手术创伤后短期内可明显升高［12］。本实验穿刺过程中胎兔亦存在胎动增多、心率加快等生理反应，若采用25 G 或更细的穿刺针可能减少该生理反应。

综上所述，羊膜腔内和胎肺注射PS均可有效预防早产兔肺损伤。与羊膜腔内注射PS相比，胎肺注射相同剂量的PS 效果可能更佳。随着超声介入技术的进一步发展和成熟，超声引导下胎肺注射PS有望成为预防早产儿肺损伤的新方法。