人工冬虫夏草对特发性肺纤维化上皮-间质转分化中信号通路的影响

黄莺 徐芳 袁文胜

摘要 目的：觀察肺纤维化动物模型中人工冬虫夏草（Ccs）是否通过TGFbeta1-Smad途径来影响肺间质纤维化上皮-间质转化。方法：将50只SD大鼠随机分为空白对照组、博来霉素组（BLM组）、博来霉素+冬虫夏草组（Ccs组）、空白质粒组、siRNA组（Smad3siRNA+博来霉素+冬虫夏草），采用气管内注入博来霉素（5 mg/kg）复制大鼠肺纤维化模型，对照组给予生理盐水1.25 mL/kg。Ccs组于造模当日开始灌胃人工冬虫夏草溶液5 g/（kg·d），空白质粒组于造模第二天进行空白质粒尾静脉快速注射（3 mL/kg）。siRNA组在每天Ccs灌胃基础上于造模次日尾静脉注射Smad3 siRNA质粒（3 mL/kg）。于第28天处死动物。行HE染色，并用RT-PCR检测肺组织匀浆中上皮细胞标志物E-cad、间皮细胞标志物α-SMA以及信号通路相关分子Smad3、转化生长因子（TGF）-β1、结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA的蛋白表达变化。结果：BLM组纤维化程度较重，Ccs组炎症程度明显减轻，纤维组织大量减少，siRNA组同Ccs组比较肺泡炎及纤维化程度有所加重;RT-PCR结果显示BLM组TGF-β1、α-SMA表达较对照组明显增高，siRNA组的α-SMA、CTGF表达较Ccs组有显著上升。结论：Ccs可能通过阻断TGFbeta1-Smad信号通路抑制肺纤维化的发生。

关键词 成纤维细胞;表型转化;TGFbeta1-Smad信号通路;人工冬虫夏草，肺间质纤维化;上皮-间质转化;转化生长因子;博来霉素

Abstract Objective：To observe the effects of cultured cordyceps sinensis（cultured cordyceps Sinensis，Ccs） in the animal model of pulmonary fibrosis induced by bleomycin（BLM） on pulmonary interstitial fibrosis by TGFbeta1-Smad pathway，and explore the mechanism of treating pulmonary fibrosis.Methods：A total of 50 rats were randomly divided into a blank control Group 10，a bleomycin Group（BLM） 10，a bleomycin and Cordyceps sinensis Group（Ccs） 10，a blank plasmid Group 10，Smad3 SiRNA gene silencing rat+bleomycin mildew element+cordyceps sinensis Group（Smad3 siRNA+BLM+CCS） 10.tracheotomy injected bleomycin（5 mg） was used to replicate mouse pulmonary fibrosis model，the control group was given saline 1.25 mL/kg.Ccs Group on the day of the modelling began to stomach artificial cordyceps sinensis solution 5 g/（kg·d），the blank plasmid group in the second day of the model for the rapid injection of empty particles of the tail vein（3 mL/kg）.The Smad3 siRNA+BLM+CCS group was injected into the Smad3 siRNA plasmid（3 mL/kg） at the end of the day after the injection of CCS on a daily basis.The animals were executed on the 28th day.In the left lung tissue，hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the degree of alveolar inflammation and pulmonary fibrosis，and the right lung was detected by RT-PCR to detect the E-cad of the upper and middle skin cells of lung homogenate，the α-SMA intercellular markers and the signaling pathway related molecular Smad3，TGF-β1，CTGF Changes in the expression of mRNA protein.Results：In BLM Group，the degree of fibrosis was heavy，the degree of inflammation in the CCS group decreased markedly，the fibrous tissue was greatly reduced，and the degree of alveolar inflammation and fibrosis in Smad3 SiRNA+BLM+Ccs group was worse than that in CCS group.The results of RT-PCR showed that TGF-β1 and α-SMA expression in BLM group increased significantly The expression of α-SMA，and CTGF in SiRNA+BLM+CCS group increased significantly compared with that in CCS group.Conclusion：CCS may inhibit the occurrence of pulmonary fibrosis by blocking the TGFbeta1-Smad signaling pathway and reduce the effect of pulmonary fibrosis by inhibiting the activation of the TGFbeta1-Smad signaling pathway.

Keywords Fibroblast; Transit; TGFbeta1-Smad signaling pathway; Cultured cordyceps sinensis; Pulmonary fibrosis; Epithelial-interstitial transformation; Transforming growth factor; Bleomycin

中图分类号：R282文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.008

肺纤维化（PF）是一种原因不明且持续性进展的疾病，目前尚无特效治疗药物。国内外研究表明，肺成纤维细胞的增殖、转化是其发生机制的关键。上皮-间质转化（EMT）被认为是成纤维细胞的一个重要来源[1-2]。近年来研究显示，TGFbeta1-Smad信号通路与肺纤维化发生发展关系密切[3-4]。而人工冬虫夏草能抑制α-SMA、TGF-β的表达[5-6]。因此推测人工冬虫夏草能通过阻断TGFbeta1-Smad信号通路，延缓肺纤维化的发展[7-8]。本实验通过博来霉素（bleomycin，BLM）复制肺纤维化动物模型，观察Smad3、转化生长因子（TGF）-β1对α-SMA、E-cad的表达的影响，并用人工冬虫夏草（Ccs）进行干预，探索中药Ccs治疗肺纤维化的作用机制，为肺纤维化的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取50只雄性SD大鼠，体质量200～300 g（济南朋悦实验大鼠繁育有限公司，动物生产许可证号：SCXK（鲁）20140007），大鼠于SPF级环境中饲养，饲养温度24～26 ℃，相对湿度50%～60%，保证饮食充足，12 h光照，12 h黑暗循环，自由饮水、进食。动物实验获本院伦理委员会批准（伦理审批号：2018003）。

1.1.2 药物 博来霉素4 mg/支（哈尔滨博莱制药有限公司，批号：20170411）;人工冬虫夏草（Cultured Cordyceps Sinensis，Ccs）（杭州中美华东公司，批号：2106306C）配置浓度为1.25 g/mL。

1.1.3 试剂与仪器 Smad3 siRNA质粒构建均由上海生物工程有限公司合成，批号：20170516;TGF-β、Smad3、E-cad、α-SMA、CTGF鼠單克隆一抗和兔抗鼠二抗（Abcam公司，美国，批号分别为：20170112、20170230、20170225、20170311、20170412、20170612、20170212、20170133、20170231、20170742）;逆转录试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，货号：CW0741S）、RT-PCR试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，货号分别为：CW07425）;HRP标记二抗（武汉博士德生物工程有限公司，货号：BA1054），引物由上海生物工程有限公司合成。全自动生化分析仪（迪瑞医疗科技股份有限公司，型号：CS-6400）;光学显微镜（Olympus公司，日本，型号：CX43）;医用离心机（湖南湘仪离心机有限公司，型号：LA500）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将50只SD大鼠随机分为空白对照组10只、博来霉素组（BLM组、模型组）10只、博来霉素+冬虫夏草组（Ccs组）10只、空白质粒组10只、Smad3 siRNA基因沉默大鼠（尾静脉注射Smad3 siRNA表达质粒）+博来霉素+冬虫夏草组（siRNA组）10只，分别于28 d处死大鼠。每组大鼠用4%水合氯醛（0.01 mL/g）行腹腔注射麻醉，麻醉后固定于手术台上，暴露气管后于气管内注药。除对照组外其余组注入博来霉素（5 mg/kg），空白对照组气管内注入生理盐水（1.25 mL/kg）制造阴性对照。

1.2.2 给药方法 空白质粒组于造模第2天进行空白质粒尾静脉快速注射（3 mL/kg）。Ccs组于造模当天开始每天用Ccs溶液灌胃（0.6 g/kg·d），siRNA组在每天Ccs灌胃基础上于造模次日尾静脉注射Smad3siRNA质粒（3 mL/kg）。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 肺组织病理学观察 大鼠肺组织用HE染色以及免疫组织化学法制成5 μm厚的石蜡切片。然后用苏木精对细胞核进行染色，时长3 min，经过流水洗、盐酸乙醇分化、再流水洗、氨水返蓝30 s，最后蒸馏水洗，在显微镜下观察切片染色情况。随后用伊红对细胞质进行染色，时长15 s。染色后再经过梯度乙醇进行脱水、二甲苯透明以及中性树胶封片。最后在显微镜下观察肺间质厚度以及肺纤维化的程度。

1.2.3.2 RT-PCR检测E-cad、α-SMA、TGF-β1、CTGF的mRNA表达 用Trizol法提取总RNA。所有标本取相同质量的RNA，然后通过逆转录成cDNA，最后用RT-PCR方法进行检测。反应体系中的引物序列见表1。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。所有数据以均数±标准差（±s）表示。通过方差齐性检测后采用两独立样本t检验;如方差不齐性，采用Manna-Whitney U检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肺组织病理学改变 在空白对照组中，肺组织切片HE染色后发现，肺泡间隔基本正常，肺泡连续性完整，肺泡直径和面积比较均匀，大部分终末小气道和血管周边没有明显炎症细胞浸润，有个别区域的终末小气道管壁可见增厚及少许炎症细胞浸润，组织中未发现纤维化改变。模型组和空白质粒组中可见肺泡间隔增宽，肺泡连续性均受到破坏，肺泡直径和面积大小变得不均匀，而终末小气道附近炎症细胞明显浸润，在血管周边也看到较多炎症细胞浸润的改变。同时可以看到肺纤维化已形成，特别是支气管周边肺纤维化改变较为明显，外周部分区域也可以看到局灶性纤维化改变。Ccs组与BLM组比较，肺组织和结构均较完整，其炎症细胞浸润明显减少，大鼠肺泡腔内可见残留少许炎症细胞，肺泡间隔缩小显著，纤维样改变组织明显减少。siRNA组与Ccs组比较，肺泡炎及纤维化程度有所加重。见图1。

2.2 各组E-cad、TGF-β、Smad3、α-SMA、CTGFmRN比较 BLM组及空白质粒组TGF-β、Smad3、α-SMA、CTGFmRN表達较对照组明显增高（P<0.05），E-cad的表达较对照组明显减低（P<0.05）。siRNA组α-SMA、TGF-β表达较Ccs组有显著上升（P<0.05），E-cad的表达较Ccs组明显减低（P<0.05）。见表2。

3 讨论

冬虫夏草是一种真菌和昆虫的复合体。寄生的真菌就是冬虫夏草菌[Cordyceps Sinensis（BerK.）Sacc.]，被寄生的虫体是虫草蝙蝠蛾的幼虫。现代研究表明，冬虫夏草具有保护肾脏，可以通过抗炎、抗氧化等作用，对人体多脏器包括肾、肝、肺以及神经系统发挥功效，特别是在抗纤维化方面的作用得到多方面的认可。人工冬虫夏草的虫草菌粉为冬虫夏草无性型发酵菌粉，与天然虫草有相似的化学成分和药理作用[9]。有研究表明，人工冬虫夏草可下调TGF-β1-Smad信号通路的下游效应因子如VEGF、CTGF、MMP-2等表达，抑制上皮细胞向成纤维细胞（MF）转化从而延缓肺纤维化的进展[10-12]。

本实验中，Ccs组的E-cad表达较BLM组显著增高，而α-SMA则明显减少，表示人工冬虫夏草抑制了成纤维细胞的增殖，减少上皮-间质转分化，从而减轻肺纤维化的发生。siRNA组较Ccs组的TGF-β1及α-SMA表达均减少，表示人工冬虫夏草能通过阻断Smad3-TGF-β1信号转导通路，减少了TGF-β1的表达，使成纤维细胞增殖减少，达到阻碍肺纤维化发展的目的[13-15]。

siRNA组中CTGF的表达较Ccs组减少，表明Ccs对Smad3-TGF-β1信号转导通路的下游因子起到了抑制作用，影响CTGF与TGF-β1结合，进一步抑制细胞外基质合成的作用。

上皮-间质转化是近年来有关肺成纤维细胞来源的研究热点，TGF-β1已被证实是诱导上皮间质转化的重要因子[16-18]。而人工冬虫夏草对肺纤维化的保护性作用是一直得到认可的[19-20]。在本实验中，Ccs可能通过阻断Smad3-TGF-β1信号转导通路，减少TGF-β的表达，并通过阻断该信号通路，减少CTGF的表达，进一步抑制上皮细胞向成纤维细胞转化，从而延缓肺纤维化的进展。

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（2020-01-17收稿 责任编辑：张雄杰）