基于网络药理学探讨麻黄附子细辛汤治疗儿童哮喘的作用机制研究

付宇 邓娜 田书芳

摘要 目的：利用网络药理学的方法预测麻黄附子细辛汤治疗儿童哮喘的活性成分，并预测其作用靶点，探讨其可能的作用机制。方法：用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）和GeneCards数据库收集麻黄附子细辛汤的活性成分及靶点，采用STRING数据库和Cytoscape软件构建药物-活性成分-靶点的网络和作用于哮喘的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，通过ClusterProfiler语言包进行GO和KEGG通路的富集分析。结果：通过口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18筛选得到35个有效活性成分，包括槲皮素、木犀草素、（+）-儿茶素等，收集了171个靶点，包括JUN、AKT1、MAPK1、MAPK3、RELA和IL6等，并富集得到多条GO功能和KEGG通路，比如TNF信号通路，AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路等。结论：麻黄附子细辛汤可能通过抑制炎症介质的表达，促进气管重塑，改善气管堵塞等而发挥治疗儿童哮喘的作用。

关键词 麻黄附子细辛汤;儿童哮喘;网络药理学;作用机制

Abstract Objective：To predict the active chemicals and targets on childhood asthma and explore the mechanism of Mahuang Fuzi Xixin decoction.Methods：Based on TCMSP and Genecards database，the active chemicals and chemicals-targets were gathered.Then drug-chemicals-targets network and PPI network were performed utilizing string database and Cytoscape software.Finally，GO and KEGG enrichment analysis were carried out by using Cluster Profiler package in R RStudio software.Results：With the setting of OB≥30% and DL≥0.18，35 active chemicals were gathered，including quercetin，luteolin，（+）-catechin and so on and 171 targets（JUN，AKT1，MAPK1，MAPK3，RELA，IL6，etc）were fished out.GO and KEGG pathways were gathered and analysed，including TNF signaling pathway，AGE-RAGE signaling pathway，IL-17 signaling pathway，HIF-1 signaling pathway and so on.Conclusion：Mahuang Fuzi Xixin Decoction may play a role in treating childhood asthma，inhibiting the expression of inflammatory factors and improving tracheal obstruction，through regulating multiple components，multiple targets，multiple signaling pathways.

Keywords Mahuang Fuzi Xixin Decoction; Childhood asthma; Network Pharmacology; Mechanism

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.005

哮喘被世界卫生组织（WHO）列为四大顽疾之一，而在我国哮喘死亡率明显高于其他国家，且有1/3的哮喘患者是儿童[1]。儿童哮喘即儿童支气管哮喘，是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症，常伴有喘息、气促、胸闷和咳嗽等症状，严重影响了儿童的生长发育与身心健康[2-3]。麻黄附子细辛汤源自《伤寒论》，由麻黄（MH）、附子（FZ）和细辛（XX）三味中药组成，具有助阳解表之功效，用于治疗太阳少阴两感疾病，比如带状疱疹，偏头痛，喑哑等[4-7]。隨着现代社会快速发展，麻黄附子细辛汤的应用范围越来越广泛，研究发现该药对儿童哮喘有一定的治疗效果，但是其作用机制尚不清楚[8-9]。中药复方成分复杂，机制不清，阐明其作用机制是亟待解决的难题，而网络药理学是结合药理学和药效学的一个新兴领域，具有整体性和系统性的特点，这与中医基于辨证论治、协同作用的总体思路相吻合[10-12]。它可以解释中药的活性化学成分和靶点，阐明其作用机制，预测新的并发症，并发现药物的综合作用。因此，本研究利用网络药理学的方法探讨麻黄附子细辛汤治疗儿童哮喘的作用机制，为麻黄附子细辛汤的进一步研究提供参考。见图1。

1 资料与方法

1.1 活性成分及靶点的收集 选用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），GeneCards数据库（https：//www.genecards.org），UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），STRING数据库（https：//www.string-db.org/），Cystoscope3.7.2软件。分别以麻黄、附子、细辛为关键词，从TCMSP软件（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中逐一获取麻黄附子细辛汤中三味中药的所有化学成分。以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件，从而得到活性成分。活性成分的作用靶点从TCMSP数据库中获得，把靶点名称输入UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），获得其相应靶点的人源靶点基因名称。以“Childhood Asthma”为检索词，利用GeneCards（https：//www.genecards.org）数据库，设定物种为“Homo Sapiens”，检索哮喘潜在靶点信息。将获得的靶点名称输入到UniProt数据库中得到靶点的基因名称（Gene Name）。利用韦恩在线绘制工具，将活性成分的靶点与疾病的靶点进行匹配，交集部分为麻黄附子细辛汤作用于儿童哮喘的潜在靶点。

1.2 网络图的构建 将活性成分与对应靶点信息导入Cystoscape3.7.2软件，构建活性成分与靶点的可视化网络图。将交集部分的靶点导入STRING数据库中，设定物种为“Homo Sapiens”，设置最高置信度值为0.9，并隐藏离散的靶点，构建蛋白互作网络图。

1.3 基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析 设定P<0.001，利用RStudio中ClusterProfiler包进行GO富集分析和KEGG代谢通路分析。先将基因名称转化为“ENTREZ ID”，选择OrgDb为“org.Hs.eg.db”，进行GO和KEGG富集分析[13]。

2 结果

2.1 活性成分的筛选 从363个麻黄成分中筛选出23个活性成分，从65个附子成分中筛选出21个活性成分，从192个细辛成分中筛选出8个活性成分。删除1个重复化合物，去除与疾病靶点无相关的化合物，最终得到35个活性成分，其中，麻黄成分22个，附子成分6个，细辛成分7个。见表1。

2.2 收集的靶点 从TCMSP中获得3 919个麻黄靶点，139个附子靶点，1 668个细辛靶点，在GeneCards数据库中共获得儿童哮喘有关靶点4 096个，删除重复的靶点以及非人类的靶点共获得216个成分靶点，最终得到171个活性成分作用于哮喘的靶点。见图2。其中，PTGS1、ESR1、PTGS2、ACHE、PRSS1、NCOA2、PGR、ADRA1B、SCN5A、ADRB2、NCOA1等11个靶点为麻黄、附子、细辛共有;NR3C2和CHEK1为麻黄和附子共有靶点;AR、PPARG、CHRM2、NOS2、CHRM1、SLC6A2、F7、RELA、IKBKB、AKT1、BCL2、BAX、TNFSF15、JUN、CASP3、MAPK8、MMP1、STAT1、HMOX1、CYP3A4、CYP1A2、CYP1A1、ICAM1、SELE、VCAM1、NR1I2、CYP1B1、ALOX5、HAS2、GSTP1、AHR、PSMD3、INSR、GSTM1、AKR1C3、SLPI、CCND1、IL10、NOS3、CHRM3、CHRM4、SLC6A4、OPRM1、UGT1A1、ESR2等45個靶点为麻黄细辛共有。说明麻黄附子细辛汤不同的成分，通过相通的靶点，进而起到协同治疗哮喘的作用，配伍具有一定的科学性。

2.3 网络图分析 通过Cystoscape3.7.2软件，绘制了活性成分与靶点的可视化网络图。见图3。活性成分的平均度值是6，其中Quercetin（槲皮素）、Luteolin（木犀草素）、Kaempferol、Naringenin（柚皮素）、Stigmasterol和Beta-Sitosterol的度值最高，分别为115、47、45、24、24和24，因此这6个成分是与儿童哮喘相关性最大的成分。

将交集靶点输入到STRING 11.0数据库中构建蛋白互作网络。设定物种为“Homo sapiens”，最低相互作用阀值设为高置信度0.7，其余参数保持默认，获得蛋白互作关系（图4），并导出蛋白相互作用关系（string_interactions）的TSV格式数据文件。并通过R程序，统计频次前20靶点，并绘制条形图（图5）。结果显示，蛋白互作频次较高的有JUN、AKT1、MAPK1、MAPK3、RELA、IL6等，表明此6个靶点在治疗儿童哮喘中发挥主要作用。

2.4 GO和KEGG富集分析 生物过程主要富集在对有毒物质的应答反应，对细胞外刺激的反应，对氧化应激的反应以及对营养水平的反应等;分子功能主要富集在蛋白质异二聚活性，辅因子结合，近端启动子序列特异性DNA结合，细胞因子受体结合以及受体调节活性等;细胞组分主要富集在膜筏、膜微区以及膜区等。从KEGG通路分析可以看出，麻黄附子细辛汤可以调控PI3K-AKT信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、内分泌抵抗、松弛素信号通路、Toll样受体信号通路、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂、T细胞受体信号通路、NF-κB信号通路等多条通路。见图6。

3 讨论

儿童支气管哮喘是一种慢性气管炎症性疾病，气道呈现高反应状态，与平滑肌功能障碍以及气道炎症均有关[14]。中医认为，儿童支气管哮喘病因为痰，诱因为外邪，痰随气升，气因痰阻，壅塞气道不利通畅，肺失宣降。在治疗上，采用辨证论治。寒痰伏肺患者以温肺散寒、化痰平喘为主;热哮患者以清热宣肺、化痰定喘为主;缓解期患者则是以脾、肺、肾论治。麻黄细辛附子汤中麻黄发汗散寒、宣肺平喘;附子回阳救逆、补火助阳、散寒止痛;细辛解表散寒、温肺化饮。现代研究表明，该复方可抑制嗜酸性粒细胞、肥大细胞等的炎症介质的释放，降低血管通透性，具有抗变态反应作用;并能诱导T淋巴细胞的凋亡，使患儿哮喘变应性炎症得到缓解。

本研究通过网络药理学的方法，对麻黄附子细辛汤治疗儿童哮喘的作用机制进行了分析。通过活性成分与疾病靶点分析可知：麻黄附子细辛汤中共35个活性成分与哮喘有关，包括Quercetin（槲皮素）、Luteolin（木犀草素）、Kaempferol、Naringenin（柚皮素）、Stigmasterol和Beta-Sitosterol及儿茶素、Sesamin（芝麻素）等。研究发现槲皮素可以降低IL-4、IL-5和Mir-155等炎症介质，从而改善哮喘小鼠的气道炎症，且随着槲皮素浓度增加，改善效果越明显[15];槲皮素还能抑制BALF及血清炎症介质水平的升高，降低肺组织中NLRP3、ASC和Caspase-1的蛋白表达，从而缓解卵清蛋白致小鼠支气管哮喘的症状[16]。木犀草素可抑制大鼠p38MAPK蛋白表达，促进PPARγ蛋白表达而抑制哮喘大鼠的气道炎症[17]。木犀草素可以降低哮喘小鼠血清MDA含量、下调肺组织COX-2、PGE2、TNF-α及IL-1β的mRNA和蛋白表达，并具有抗氧化应激的作用，从而减轻哮喘小鼠气道炎症[18]。对鸡卵清蛋白（OVA）致敏和激发的过敏性哮喘小鼠给予儿茶素后，发现外周血白细胞总数减少，肺组织中TSLP以及Th2型炎症介质IL-5、IL-13的含量均减少，核因子κB P65核转录被抑制，从而缓解过敏性哮喘小鼠的炎症反应[19]。柚皮素可以抑制人气道上皮细胞的下游因子PI3K、PKB、p-PKB及核因子κB蛋白的表达而改善炎症性气道黏液高分泌的情况[20]。芝麻素是细辛中的成分，研究发现，与哮喘组小鼠比较，芝麻素可以降低炎症细胞计数，降低IL-4、IL-5、IL-13水平，提高IFN-γ的表达，抑制IκBα磷酸化和核因子κB激活，而改善哮喘的炎症反应[21]。

麻黄附子细辛汤中35个活性成分的作用靶点中，与哮喘相关的共171个，其中JUN、AKT1、MAPK1、MAPK3、RELA和IL6等靶点的度值最高，可能在麻黄附子细辛汤中发挥重要作用。AKT1是一种激酶，可以调节代谢，增殖，细胞成活，生长和血管生成，哮喘大鼠接触过敏原后，肺组织中PTEN mRNA表达量降低，AKT1mRNA表达量升高，说明AKT1的过度表达可加剧哮喘症状[22]。Yang等[23]研究发现哮喘患儿的MAPK1甲基化水平低于非哮喘患儿，控制MAPK1甲基化可有效改善哮喘;赵振营[24]研究发现MAPK3参与了哮喘患者的炎症信号传导、气道平滑肌细胞凋亡的调节;李海银[25]发现RelA可参与调节中性粒细胞哮喘的中性粒细胞凋亡。丁召磊等[26]发现哮喘动物气道中IL6明显增加。综上所述，麻黄附子细辛汤可能通过调节相关基因的表达，以缓解气道炎症和气道阻塞等，从而发挥缓解哮喘症状的作用。

根据KEGG和GO富集分析结果可知，麻黄附子细辛汤可能是通过PI3K-AKT信号通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路以及酪氨酸激酶抑制剂等，完成有毒物质的应答、氧化应激反应等生物过程以及分子功能和细胞组分等的调节，从而发挥治疗或预防哮喘的作用。研究发现，通过抑制PI3K/AKT信号通路，可减缓气道炎症反应，减低气道的高反应性，从而缓解气道重塑达到哮喘治疗的效果[27-28]。酪氨酸激酶抑制剂能够减轻慢性哮喘小鼠气道重塑的程度，对哮喘气道重构具有一定的防治意义[29-30]。TNF信号通路，可上调相关基因及趋化因子，从而导致哮喘的炎症和免疫反应加重[31]。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法探讨了麻黄附子细辛汤在哮喘治疗方面的作用机制，获得了麻黄附子细辛汤治疗哮喘的潜在成分、靶点以及信号通路等，为该方在哮喘治疗方面提供了研究思路。但由于网络信息技術的延时性以及药物的复杂性，后续将对活性成分及靶点进行药理学验证，以明确麻黄附子细辛汤治疗儿童哮喘的作用机制，以便更好地应用于临床。

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（2020-12-03收稿 责任编辑：魏庆双）