黄连-吴茱萸不同比例配伍水提物对线虫的毒性效应评价

2021-01-13路颖慧康念欣袁炎炎李晴霞谭鹏

世界中医药 2021年24期

路颖慧康念欣袁炎炎李晴霞谭鹏

摘要目的：評价不同比例黄连-吴茱萸配伍提取物对秀丽隐杆线虫的毒性效应。方法：以秀丽隐杆线虫为模式生物，制备不同比例黄连-吴茱萸配伍水提物，测定各水提物对秀丽隐杆线虫寿命、体长及运动行为的影响。每组30条线虫观察存活率，每天在相同时间观察线虫数量，以最后一条线虫死亡时间作为最长寿命;每组40条线虫观察体长，用Image J软件测量死亡线虫虚拟体长;每组30条线虫观察头尾摆动和身体弯曲频率，测定1 min内线虫头部摆动的次数（从一侧摆向另一侧再摆回来）和20 s内身体弯曲的次数（认为线虫相对于身体的长轴移动一个正弦周期的波长为1次身体弯曲）。结果：与黄连组比较，随吴茱萸相对比例增加，秀丽隐杆线虫的死亡率显著降低（P<0.01）;体长显著减少（P<0.01）;对秀丽隐杆线虫的运动行为没有明显的抑制作用。结论：吴茱萸在一定程度上能够降低黄连对秀丽隐杆线虫的毒性，延长其寿命;在生长发育和神经方面影响较小，本研究为黄连和吴茱萸的配伍与炮制减毒研究提供了新的方法。

关键词黄连;吴茱萸;秀丽隐杆线虫;寿命;体长;运动行为;毒性;炮制减毒

Abstract Objective：To evaluate the toxic effects of different proportions of Coptidis Rhizoma and Tetradium ruticarpum extracts on Caenorhabditis elegans.Methods：Coptidis Rhizoma was used as model organism and preparing water extracts of Coptidis Rhizoma and Tetradium ruticarpum in different proportions。Assessing the effects of various water extracts on the survival rate，body length，head and tail swinging frequency and body bending frequency of C.elegans.The number of 30 C.elegans were observed and counted at the same time every day，and the death time of the last C.elegan was taken as the maximum life span.The body length of 40 C.elegans was measured by Image J software after C.elegans were killed in the oven and photographed.Counting the number of head and tail swinging frequency of 30 C.elegans in 1min（from one side to the other and back again） and the number of body bending frequency of 30 C.elegans in 20s（the movement of nematodes relative to one wavelength along the long axis of the nematode was taken as one body bending） to evaluate the effects on motor behavior of C.elegans.Results：Compared with the group of Coptidis Rhizoma，as the relative proportion of Tetradium ruticarpum increasing，the mortality rate of C elegans was significantly decreased（P<0.01）.The body length was significantly reduced（P<0.01）.In the aspect of locomotion behavior，the addition of Tetradium ruticarpum can′t significantly reduces the frequency of head swing and body flexion of C.elegans.Conclusion：To a certain degree Tetradium ruticarpum can reduce the toxicity of Coptidis Rhizoma to C elegans，extending its life.In terms of growth and nerves，it has less affection.And the research provided a new method for the study of Coptidis Rhizoma and Tetradium ruticarpum in pairing and concoction.

Keywords Coptidis Rhizoma; Tetradium ruticarpum; Caenorhabditis elegans; Lifespan; Body length; Sports behavior; Toxicity; Concoct attenuation

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.002

黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.、三角叶黄连Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎。苦，寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。具有清热燥湿，泻火解毒的作用，用于湿热痞满，呕吐吞酸，泻痢等症[1]。黄连中所含化学成分主要有生物碱类，以小檗碱含量最高，还有巴马汀、表小檗碱、四氢小檗碱等。除此之外，还含有木脂素类、黄酮类、鞣质、酸性成分、多糖等多种成分。在降糖、抗菌、抗炎、抗氧化等方面有显著的药理作用[2]。吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果实。辛、苦，热，有小毒，归肝、脾、胃、肾经[1]。具有散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻的功效[3]，用于厥阴头痛，寒疝腹痛，寒湿脚气等症。吴茱萸中所含化学成分主要有生物碱类，以吴茱萸碱和吴茱萸次碱为主，还有挥发油、柠檬苦素类和黄酮类化合物等多种成分[4-5]。在抗肿瘤、抗炎镇痛、抑菌、降血脂等方面有显著的药理作用。

黄连和吴茱萸常配伍或炮制后使用。萸黄连，即以吴茱萸煎液与净黄连拌匀，待液吸尽，炒干，具有疏肝和胃止呕的作用，用于肝胃不和，呕吐吞酸[1]。二者配伍使用的历史非常悠久，首载于北宋的《太平圣惠方》，黄连-吴茱萸1∶1配伍组成茱萸丸，用于下痢水泻[6]。最著名的是朱震亨的《丹溪心法·火六》中记载的左金丸，由黄连-吴茱萸6∶1配伍而成。此外，历代还有许多黄连-吴茱萸配伍的方剂。见表1。

黄连、吴茱萸一苦一辛、一寒一热、一阴一阳，二药配伍体现了“辛开苦降”“反佐”的思想，是中医治疗八法中“和”法的代表，极具中医特色[7-8]。因此，黄连-吴茱萸配伍的药理作用一直是研究的热点。有研究发现，黄连水提物可对小鼠造成急性毒性作用，其毒性与乙酰胆碱酯酶抑制、肠道P-糖蛋白功能受损、肠黏膜Ⅰ相及Ⅱ相代谢能力降低等因素有关[9]。有文献报道黄连经口急性毒性LD50为18.82 g/kg。有研究者以0.5 mg/mL剂量以0.2 mL/10 g灌胃小鼠，造成肝损伤，其病理变化随着剂量的增加而加重[10]。而在黄连之前给予吴茱萸，其毒性明显降低。

评价中药的毒性，主要采用动物实验，以啮齿类动物如大鼠、小鼠、豚鼠等为主，也有应用犬或猴为实验对象的[11]。这些实验动物价格高昂、饲养困难、试验周期长，而且传统化学药物的毒理学评估方式不能解释清楚成分复杂的中药的毒性机制。所以，评价中药的毒性需要一种迅速、简便、可靠的方法。作为一种结构简单、生命周期短，与人类基因保守性较高的模式动物[12]，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis Elegans，简称“线虫”）因此被广泛用于生命科学领域。李煜等[13]以秀丽隐杆线虫的发育、运动、消化功能、寿命和繁殖能力为指标，评估威尼斯不动杆菌（Av）的致病性，说明秀丽隐杆线虫可以作为致病性评价体系的筛选方案。有研究利用线虫（N2 strain）建立了粪肠球菌持久感染模型[14-16]，并用其研究金黄色葡萄球菌的关键致病因子。线虫还可作为抗衰老领域研究的动物模型，王丽萍等[17]发现，其自主设计合成的新型模拟酶-抗坏血酸过氧化物酶（DhHP-6）可延长野生型线虫的平均寿命。秀丽隐杆线虫因为是具有高度保守性的简单多细胞真核生物，可以用于细胞凋亡的深入研究[18]。Kokel等[19]发现含萘的环境可以阻止线虫体内部分细胞的凋亡，这种现象在缺少凋亡酶-胱天蛋白酶的情况下更加明显。秀丽隐杆线虫也是研究发育生物学和神经生物学的理想模型动物。在帕金森病的研究中，有学者在研究多巴胺能神经元损伤时，用化学药物诱导秀丽隐杆线虫制作转基因模型[20]。此外，秀丽隐杆線虫还可用于中药活性及毒性的评价，以寿命、体长、运动行为、产卵率等为指标，魏巍等[21]发现蓖麻水提物可以使线虫的生殖能力降低或丧失，许云等[22]发现芫花素可以抑制线虫的运动行为，对其有一定的毒性。基于上述优势，线虫在测试环境生态毒性、筛选药物、研究人类疾病、评价中药毒性等方面得到广泛应用。

前期研究用秀丽隐杆线虫评价了黄连的毒性效应，发现黄连水提取物对线虫有较为强烈的毒性，本研究则通过测定不同质量浓度的黄连-吴茱萸不同比例配伍提取物对线虫的死亡率、体长和运动行为的影响，探究黄连、吴茱萸反佐配伍的减毒效果，为黄连、吴茱萸的临床使用提供实验依据，为使用线虫快速评价中药的不良反应方式提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物野生型N2秀丽隐杆线虫（C.elegans of Wild-type Strain）于20 ℃生化培养箱中培养、大肠杆菌OP50于4 ℃冰箱中保存，均由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供。

1.1.2 药物黄连（北京市双桥燕京中药饮片厂，批号：1604034），经北京中医药大学中药学院杨瑶珺教授鉴定为毛茛科黄连属植物黄连Coptis chinensis Franch.干燥根茎。吴茱萸（安徽益生源药业有限公司，批号：17090470），经北京中医药大学中药学院杨瑶珺教授鉴定为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果实。

1.1.3 试剂与仪器琼脂粉（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20200518）、蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20181206）、胰蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20180206）、胆固醇（北京博奥拓达科技有限公司，批号：160612）、酵母粉（赛默飞世尔科技公司，美国，批号：1149159）、氯化钠（北京化工厂，批号：20160105）、磷酸二氢钾（北京化工厂，批号：20190516）、氢氧化钾（北京化工厂，批号：20161124）、硫酸镁（北京化工厂，批号：20150317）、氯化钙（北京化工厂，批号：20160808）、十二水合磷酸氢二钠（北京化工厂，批号：20160216）、氯化铵（北京化工厂，批号：20150929）等均为分析纯。

千分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司，型号：BSA224S）、立式高压蒸汽灭菌器（上海云泰仪器仪表有限公司，型号：LT-CPS50C）、恒温水浴锅（余姚市上通温控仪器厂，型号：HHS11S）、超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SB25-12DTD）、微量移液器（Eppendorf公司，型号：K36113B）、生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，型号：LRH-150）、体式显微镜（上海尼康仪器有限公司，型号：SMZ800N）。

1.2 方法

1.2.1 黄连-吴茱萸水提物的制备准确称取黄连、吴茱萸共12 g，粉碎后加6倍量水（72 mL）在200 mL烧瓶内水浴回流1.5 h，滤过，药渣再加4倍水（48 mL），回流1 h，滤过，合并两次滤液，水浴蒸干，滤过，得到黄连-吴茱萸水提液，加热挥干，得到黄连吴茱萸水提物，使用时用大肠杆菌溶液配成所需浓度。黄连-吴茱萸配伍比例见表2。

1.2.2 培养基及缓冲液的配制 LB液体培养基、线虫生长培养基（NGM培养基）和M9缓冲液的配方见表3。

1.2.3 线虫的基本培养将秀丽隐杆线虫放于NGM培养基上，投喂大肠杆菌OP50，在22 ℃恒温培养箱培育。为保证线虫的生活空间和食物充足，每3 d转板1次，并保持培养基洁净[23]。

1.2.4 线虫的同步化处理准备一个新的NGM培养基，涂布20 μL新鲜食物菌OP50，挑取60条左右产卵期的成虫于新培养基上，约2 h后挑走全部成虫，余下留有虫卵的培养基，在22 ℃无菌生化培养箱中培养2 d，得到同步化处于L4时期的线虫[24]。

1.2.5 线虫存活率的测定在涂有0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL不同比例配伍黄连-吴茱萸水提物的NGM培养基中分别放置30条同步化的处于L4时期的线虫，22 ℃下培养。因为给药期间线虫会产卵，所以每隔24 h将存活的给药线虫挑到新的含相同药物质量浓度的培养板上继续培养，避免与新生幼虫混杂。每天在相同时间观察并记录线虫死亡的数目，当线虫停止运动，触碰没有反应时即认为死亡，记录最后一条线虫的死亡时间为最长寿命[25]。

1.2.6 线虫体长测定在NGM培养基上涂布0.5 mg/mL不同比例配伍的黄连-吴茱萸水提物溶液配制的大肠杆菌OP50，使L4时期线虫暴露在中24 h后，将培养基放在50 ℃烘箱中处理5～10 min，待线虫全部死亡后，显微镜下进行图像采集，利用Image J软件进行图像分析，测量线虫虚拟体长。

1.2.7 线虫头部摆动频率测定 L4时期线虫经过在0.5 mg/mL不同比例配伍的黄连-吴茱萸水提物中暴露24 h后，在未添加大肠杆菌OP50的NGM培养基上放置30条线虫，滴加缓冲液，记录60 s线虫头部摆动的次数（将线虫头部从左摆到右边再回到左边记为一次摆动）[26]。

1.2.8 线虫身体弯曲频率测定 L4时期线虫经过在0.5 mg/mL不同比例配伍的黄连-吴茱萸水提物中暴露24 h后，在未添加大肠杆菌OP50的NGM培养基上放置30条线虫，滴加缓冲液，记录20 s线虫身体弯曲的次数（认为线虫相对于身体的长轴移动一个正弦周期的波长为1次身体弯曲）[27]。

1.3 统计学方法所有实验平行重复3次，采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，其中计数资料以百分率表示，采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄连吴茱萸不同比例不同浓度水提物对线虫存活率的影响不同培养时间下，0.5 mg/mL黄连-吴茱萸水提物不同配伍比例组对线虫存活率的影响。见图1。

不同培养时间下，1.0 mg/mL黄连-吴茱萸水提物不同配伍比例组对线虫存活率的影响结果见图2。

不同培养时间下，2.0 mg/mL黄连-吴茱萸水提物不同配伍比例组对线蟲存活率的影响结果见图3。

以生品黄连为对照，不同浓度黄连-吴茱萸水提物对线虫死亡率的影响为2.0 mg/mL<1.0 mg/mL<0.5 mg/mL，2.0 mg/mL组延长线虫寿命最为显著。每个浓度下，不同比例配伍黄连-吴茱萸对线虫死亡率随吴茱萸相对比例的增加而降低，说明吴茱萸能够抑制黄连的毒性，使线虫寿命增加。

2.2 黄连吴茱萸不同比例水提物对线虫身体发育的影响在之前的研究中发现，黄连水提物对秀丽隐杆线虫具有明显的毒性作用，能使线虫的寿命、体长、头部摆动频率和身体弯曲频率显著降低，且随浓度增加，毒性作用增强。为防止毒性过大影响实验，选用0.5 mg/mL浓度组进行体长和运动行为实验。见图4。对照组生品黄连线虫体长为（291.2±5.381），黄连-吴茱萸不同比例配伍水提物组线虫体长分别为6∶1组（242.6±5.921）、5∶2组（249.2±5.048）、2∶1组（252.6±5.499）、3∶2组（248.5±4.301）、1∶1组（250.5±6.329）、1∶2组（255.5±5.960）、吴茱萸组（229.3±4.706）。与对照组比较，各组线虫体长均极显著减小（P<0.000 1），吴茱萸相对比例和线虫体长之间无明显线性关系。说明吴茱萸对黄连抑制的毒性有关。

2.3 黄连吴茱萸不同比例水提物对线虫运动行为的影响神经系统是对运动行为调节起主导作用的系统，因此可用线虫头部摆动和身体弯曲情况反映运动行为的好坏，从而衡量神经系统的基本功能，此种方法广泛应用于评价药物的神经毒性、有机化合物的毒性以及环境污染情况等。见图5～6。生品黄连组线虫头部每分钟摆动频率为（101.3±3.395）次，身体弯曲频率为每20秒（35.8±1.337）次;与生品黄连组比较，6∶1、5∶2组线虫的头部摆动频率的差异无统计学意义（P>0.05），2∶1、1∶1组的头部摆动频率显著降低（P<0.01），3∶2、1∶2和吴茱萸组的头部摆动频率极显著降低（P<0.000 1）;6∶1、5∶2、1∶2组线虫的身体弯曲频率与生品黄连组比较，差异无统计学意义（P>0.05），2∶1、1∶1组的身体弯曲频率显著降低（P<0.01），3∶2和吴茱萸组的身体弯曲频率极显著降低（P<0.000 1）。说明吴茱萸不能缓解黄连对线虫神经系统的抑制作用。

3 讨论

秀丽隐杆线虫是一种多细胞真核生物，经过科学家长期大量的研究，已知线虫的生命周期、细胞谱系、基因组序列等，且因为其生命周期短、易于培养等优势，可实现快速、高通量的化学品筛选[30]。与其他模式生物比较，雌雄同体的线虫自体受精能产生非常纯合的基因型，可以避免个体差异，再加上秀丽隐杆线虫可以很好地代替啮齿类动物进行毒性试验，在预实验时使用更加经济，减少哺乳类实验动物的消耗，符合3R原则，保证动物福利，因此广泛用于药物初步毒性评价及活性筛选，能够更加准确、快速地评价中药的生物毒性，阐明中药毒性的作用机制，可用于建立规范的毒性评价系统[31-32]。

黄连性味苦、寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的功效。吴茱萸性味辛、苦、热，有小毒，归肝、脾、胃、肾经，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效。黄连与吴茱萸的配伍，属于寒热配对，二者一寒一热，一苦一辛，一降一升，一阴一阳，相反相成，互为母子（五行）[28-29]，虽仅两味药，但应用非常广泛。本研究发现吴茱萸在一定程度上能够降低黄连对秀丽隐杆线虫的毒性，延长其寿命，而在生长发育和神经方面影响较小。黄连-吴茱萸配伍主要导致二者化学成分的溶出率增加或降低或生成新化合物，其中黄连生物碱溶出率随黄连比例增加而降低，吴茱萸脂溶性生物碱溶出率随黄连比例增加而升高[33]。推测黄连生物碱可能是降低线虫寿命的主要成分，因此当其溶出率下降后会使线虫寿命延长。吴茱萸有小毒，还能促进黄连生物碱在小肠部位的吸收[34]，这2个因素可能是造成吴茱萸降低黄连对线虫发育和神经毒性不明显的原因，需要进一步研究黄连、吴茱萸毒性作用的机制和配伍的机制。

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