怀牛膝多糖的提取分离及生物活性研究进展*

胡建平，孙延平，苏发智，王洋洋，匡海学

（黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

（怀）牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata B1.的干燥根，呈细长圆柱形，挺直或稍弯曲，长15～70cm，直径0.4～1cm，气微、味微甜而稍苦涩，归肝、肾经; 是一种中医临床上具有利尿通淋，逐瘀通经，引血下行，补肝肾，强筋骨药用价值的药材[1]。怀牛膝中含有多种主要化学成分，包括皂苷，甾酮类、多糖类、甜菜碱和多种微量元素等[2-5]。近年来，怀牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharides, ABP）受到了国内外学者的关注，药理研究表明，ABP 是其重要药效物质基础并具有骨保护、抗癌、增强免疫等[6-8]生物作用；在临床应用和保健品中具有很大的开发潜力。为更好地合理利用中药怀牛膝资源，本文综述了关于ABP 的分离提取、含量测定和生物活性方面的研究。

1 怀牛膝多糖提取方法

多糖属于易溶于水的极性大分子化合物，但难溶于乙醇，所以常用水溶剂法提取多糖并采用一定浓度的乙醇去除多糖中单糖、生物碱、有机酸等小分子杂质。通常情况用热水提取植物多糖，然后用高浓度的乙醇沉淀浓缩过后的水煎液得到粗多糖。采用传统水煮提取法提取多糖，以苯酚-硫酸法检测多糖含量，通过单因素考察、正交试验优选水煮提取法中料液比、提取时间、提取次数对ABP 得率的影响；侯剑萍等人[9]得出各因素影响程度依次为：提取次数>提取时间>加水量，最佳工艺条件为：10 倍量水，提取 3 次，每次 2h；王媛媛等人[10]研究表明，ABP 的最佳提取工艺为料液比（g·mL-1）1∶13，提取时间 4h，提取次数3 次。传统多糖提取方法往往存在有效成分损失大、工序复杂、提取周期长、提取率较低等缺点。郭婕等人[11]通过对微波辅助法提取怀牛膝中多糖，通过单因素及正交试验筛选优化，确立了ABP 微波提取工艺条件：微波功率 600W、料液比（g·mL-1）1∶20、浸取温度为70℃、微波处理时间4min，在此条件下，ABP 的提取率可达12.37%。通过微波辅助提取和热水浸提两种方法提取怀牛膝茎叶多糖，对怀牛膝茎叶多糖的提取率分别为103.79、89.58mg·g-1，表明微波提取比传统水提具有更大的优势，且微波辅助提取液表现出对农杆菌及大肠杆菌的抑菌效果较好[10]。魏涛等人[12]在传统水提法的基础上，利用超声波辅助处理，在单因素实验基础上采用正交实验得出提取ABP 的适宜工艺为超声波功率1000 W、提取温度 60℃、提取时间 60min、料液比（g∶mL）1∶30；在此提取工艺条件下，粗多糖得率为 6.1%，体外抗氧化性实验表明，提取的ABP 具有较好的抗氧化性，对H2O2、O2-·和·OH 的清除率分别可达到 75.1%、90.3%和61.3%。

2 怀牛膝多糖的分离纯化

由于初步制得的粗多糖中成分复杂，包含低聚糖、色素、蛋白质及其他小分子杂质，从而影响了多糖的纯度。因此，为获得高纯度的多糖均一组分，需要对粗多糖进一步提纯。色素在粗多糖中通常以游离或者结合态存在，常用去除多糖中色素的方法包括物理吸附法、氧化法和离子交换法等；其中活性炭吸附法和双氧水氧化法多被采用。Sevage 法、三氯乙酸（TCA）法、酶解法等是常用来脱多糖蛋白的方法，在ABP 的提取纯化中，侯剑萍等[9]发现脱蛋白工艺中，三氯乙酸（TCA）法优于 Sevage 法和鞣酸法，不仅可以有效去除蛋白，同时多糖成分损失较少，且可显著去除表观色素。此外，Sevag 法、壳聚糖絮凝法、三氯乙酸及酶解法这4 种脱蛋白方法经脱蛋白实验对比后，发现酶解法能有效脱蛋白且具有操作简单、损失小、效率高的特点，并且还具有维持多糖活性及预防试剂危害等优点[13]。由于粗多糖中含有一些蛋白复合物，因此，无法将多糖中的蛋白质彻底除去。粗多糖中的小分子如氨基酸的除去等常用透析法，该方法的关键是选择一种适宜的透析膜，以免多糖样品的损失；另外，离子交换树脂和凝胶色谱柱也常用来除去多糖中的小分子杂质。

3 怀牛膝多糖的含量测定

多糖的含量检测方法主要为化学法和色谱法两类，其中化学法是利用组成多糖的单糖缩合反应为基础建立的间接测量多糖含量的方法，多用于总多糖的含量测定，如苯酚-硫酸法，蒽酮-硫酸法等；这两种方法由于操作简单、反应快速、重现性好、试剂易获取而在多糖含量测定被广泛应用。李根林等人[14]对比两种方法处理ABP，选择显色灵敏度较高、稳定性较好的苯酚-硫酸法测定8 个不同产地的ABP含量，结果显示，河南武陟产地多糖较高达8.66%。而色谱法如气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC）可直接测定多糖本身，多用于均一多糖的纯度测定。

4 生物活性

4.1 抗癌

多糖是一种具有免疫刺激活性而能够对抗癌症的物质，可通过调节机体的免疫系统达到抗癌的目的，这被认为是其抗肿瘤作用的主要机制且具有无毒的优点[15]。

目前，关于多糖抗癌作用方面研究比较多。通过对比空白对照组、多糖不同浓度治疗组，发现不同浓度ABP 均可抑制肺腺癌细胞LTEP-a-2 的细胞分裂、增殖，促进细胞凋亡，且低浓度时表现的更为明显，这与以往的研究结果相一致[16]，即低剂量ABP可显著抑制C57BL/6 小鼠Lewis 肺癌生长，高剂量多糖无明显抑制作用，但脾脏重量明显增加，对小鼠的脾细胞毒作用明显减弱，发现高剂量ABP 能显著上调小鼠脾脏 IL-6 mRNA 和 TNF-α mRNA 的表达，提示小剂量牛膝多糖通过影响肿瘤细胞周期分布而抑制肿瘤生长。ABP 作为一种转移化学预防药物可通过靶向EGFR 和EMT 安全地预防非小细胞肺癌转移，对EGFR 相关的非小细胞肺癌具有临床意义[17]。另有研究表明，ABP 对S180 荷瘤小鼠有明显抑瘤作用，且与化疗药物环磷酰胺（在无明显抑瘤作用的剂量时）有协同抗肿瘤作用，ABP 能显著提高S180 荷瘤小鼠脾细胞诱生LAK 细胞活性和TNF-β生成；对S180 细胞膜生化特性变化分析结果表明，ABP 引起细胞膜唾液酸含量升高、膜磷脂含量降低；提示ABP 对细胞膜生化特性与机体免疫功能的影响可能与其抗瘤机理有一定联系。这些说明了ABP 在抗癌方面具备一定的治疗潜力与开发价值。

4.2 免疫调节

机体的免疫功能包括特异性与非特异性机制。非特异性免疫也被称为先天免疫或固有免疫，是指对所有具有一定抵抗力的病原微生物的防御，它没有特殊的选择性；特异性免疫是有选择性地保护机体免受微生物或其产物的伤害，包括体液免疫和细胞免疫。通常情况下，免疫作用是多层面、多途径共同参与的[18]。免疫功能则是通过对非特异性免疫巨噬细胞、特异性免疫T 淋巴细胞、体液免疫B 淋巴细胞、细胞因子及免疫器官等的考察显现出来。研究发现, ABP 高剂量组能显著提高雏鸡的体液免疫、细胞免疫水平和免疫器官指数；表现在ABP 高剂量组的抗体效价高、可显著提高雏鸡外周血中CD3+CD4+T 淋巴细胞的百分率和CD4+/CD8+比值[19]。ABP 也可通过促进小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1 细胞中TNF-α 因子分泌的途径产生免疫活性来发挥抗炎活性，相比于川牛膝多糖体现出更强的优势[20]。此外，免疫调节性植物化学物质可增强断奶仔猪的免疫应答，在添加ABP 的断奶仔猪中，通过调节抗体、补体 C3、C4，和细胞因子 IL-2、IFN-γ 的产生，提高了细胞和体液免疫水平，对感染的非特异性防御具有重要的保护作用[21]。这表明中草药多糖ABP 作为一种天然的绿色饲料添加剂，可促进断奶仔猪的免疫应答和健康生长，为断奶仔猪提供了一种有效的抗生素替代品。

4.3 抗骨质疏松

ABP 是治疗骨质疏松症的重要中药，表现在对去卵巢大鼠骨密度、骨矿含量、骨小梁厚度、骨小梁数量和生物力学性能均有显著的改善作用，说明ABP 对去卵巢大鼠骨质疏松有显著的治疗作用[22]。基于UPLC/Q-TOF-MS 的代谢组学分析为评价牛膝多糖的抗骨质疏松作用，确定了ABP 能显著增加戊二酰肉碱、磷脂酰胆碱（18∶1）和9-顺式维甲酸等生物标志物，表明ABP 对脂质代谢有调节作用可能是治疗骨质疏松症重要机制。杨军英等人[23]发现ABP结合游泳训练能够明显延长部分肝切除（PH）大鼠的游泳致力竭时间（P＜0.01），使骨髓增生程度更活跃，有核细胞数增多，红细胞数量减少，促进骨髓细胞 PCNA 的表达（和 PH 相比，P＜0.01）。这些反映了ABP 在治疗骨质疏松症方面有很好的潜力。

4.4 抗病毒

采用氯磺酸-吡啶法对ABP 进行硫酸化，用MTT 法检测硫酸化后的ABP（ABPS）在MARC-145细胞上的抗呼吸综合征病毒（PRRSV）活性，结果显示，与未修饰的ABP 相比，ABPS 在较低浓度下表现出明显的抗病毒活性，表明硫酸化修饰可以增强ABP 的抗病毒活性[24]。Peng 等人[25]对从怀牛膝中分离鉴定的ABP 硫酸化衍生物的体内外抗人类免疫缺陷病毒1 型（HIV-1）活性进行了研究，发现其对HIV-1 逆转录酶、整合酶和HIV-1P24 抗原均有活性，其抑制逆转录酶、整合酶的半数抑制浓度分别为（2.948+/-0.556）mol·L-1和 （0.155+/-0.030）mol·L-1，其腹腔注射吸收良好，但口服生物利用度较差。

4.5 抗衰老

Deng 等人[26]探讨了ABP 对 D-半乳糖致衰老小鼠非酶糖基化的抑制作用及其机制，发现ABP 能降低D-半乳糖衰老模型小鼠血清AGE 水平、皮肤羟脯氨酸浓度和自发运动活性，提高淋巴细胞增殖和IL-2 活性，提高小鼠学习记忆能力和红细胞SOD 活性；表明ABP 对D-半乳糖致衰老小鼠体内非酶糖基化均有抑制作用，且通过对比枸杞多糖提示ABP的抑制作用更强。

5 结论和展望

本文综述了ABP 的提取分离、纯化、含量测定的方法及生物活性的介绍。微波和超声波辅助提取分离多糖方法比传统水煎煮法更具优势；ABP 具有广泛生物活性，包括免疫调节、抗骨质疏松和抗癌等作用。目前，研究主要集中在多糖的提取分离、含量测定、结构表征与药理作用方面，下一步需要进一步优化提纯工艺，提高纯度，明确其各级结构及构效关系，深入探讨药代动力学及药理作用机制，以扩大我们对多糖功能效应的认识；本综述也为怀牛膝更广阔的应用前景和价值研究奠定了基础。