盐炙杜仲对维甲酸诱导的骨质疏松大鼠骨生长因子及骨代谢的影响

熊 伟，赵 亮

(1.武汉市第一医院(武汉市中西医结合医院)，湖北 武汉430022；2.武汉市中医医院，湖北 武汉430014)

骨质疏松(Osteoporosis，OP)是一种骨代谢性疾病，以骨微量结构损伤、骨量、骨密度损失为主要特征，多发于老年人。随着我国人口老龄化日益严重，OP发病率随之上升，据预测，2020年我国将有近3亿OP患者，约占世界的50%以上[1]。OP极易引发骨质疏松性骨折(Osteoporotic fracture，OPF)，严重影响生活质量。

杜仲为传统中药，历史悠久，其主要功效为补肾阳、纳气、强筋骨，多用于肝肾不足、腰膝酸痛[2]。杜仲中含有的总黄酮可促进骨细胞合成Ⅰ型胶原蛋白，可以有效改善OP患者症状。一定浓度的杜仲提取物能够促进骨细胞因子生长、抑制相关炎性因子的表达，达到防治OP的目的[3]。目前，西医治疗OP多使用骨吸收抑制剂、骨形成促进剂、骨矿化物三大类，疗效有一定的局限性，且存在药物不良反应，因此，亟需寻求更有效且副作用小的治疗方案。为此，本实验通过建立维甲酸诱导的OP大鼠模型，观察骨密度、骨生长因子及相关细胞因子，探究盐炙杜仲治疗OP的疗效，明确其抗骨质疏松作用，为临床新药应用提供依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠60只(200±10 g/只)，3月龄，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心(合格证号：SCXK(鄂)2016-0005)，饲养环境为SD大鼠饲养SPF级屏障环境。

1.2 实验药物

盐炙杜仲提取物(武汉市中医医院药学基地提供，按照高、中、低剂量组给药，生药量分别换算为6、3、1.5 g·kg-1)；骨疏康颗粒(辽宁康辰药业有限公司购得，批号：国药准字Z20003255)；维甲酸(陕西森弗生物技术有限公司，纯度99.12%，批号081210)加纯水配制成混悬液使用；0.5%CMC-Na(武汉谷歌生物有限公司)。

1.3 试剂及仪器

Prodigy型骨密度仪(GE，美国)；ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；ADVIA2400全自动生化分析仪(西门子医学诊断产品(上海)有限公司)；电子天平HZT型(北京实验仪器生产有限公司)；骨钙素试剂盒(武汉英颢科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 分组与造模

将60只SPF级雄性SD大鼠适应性饲养1周后，观察其身体状态，按体质量随机分为六组：空白组、模型组、阳性对照组[骨疏康颗粒(5 g(生药)/kg)]及杜仲高、中、低剂量组(6、3、1.5 g/kg；生药)。空白组予以0.5%CMC-Na溶液，其他各组每日相同时段灌胃100 mg /kg维甲酸，连续14 d，建立大鼠骨质疏松模型[4]。

2.2 给药方法

确定造模成功后，各组给予大鼠相应药物灌胃，1次/d，共4周。杜仲高剂量组给予6 g/kg剂量溶液灌胃；杜仲中剂量组给予3 g/kg剂量溶液灌胃；杜仲低剂量组给予1.5 g/kg剂量溶液灌胃；空白组和模型对照组给予等体积0.5% CMC-Na溶液灌胃。每周测量大鼠体质量，以调整剂量。每日给药体积1 mL/100 g。

2.3 指标检测

2.3.1 骨密度检测 将大鼠麻醉后置于DEXA探头下，固定四肢，脊椎呈中立位，采用双能X射线密度仪对大鼠股骨骨痂BMD和BMC进行检测。

2.3.2 血清生化指标检测 药物干预结束后，各组大鼠禁食24 h，次日每只大鼠按3.5 mL/kg剂量腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉。取血清：经心脏穿刺采血，以4 000 r/min，4 ℃离心10 min，分离血清，收集上层血清，低温保存。按ELISA试剂盒说明书上的步骤检测分析血清TNF-α、IL-6、E2、BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠骨痂BMD、BMC比较

与空白组相比，模型组大鼠股骨骨痂BMD、BMC数值显著降低(P<0.05)；与模型组相比，杜仲中、高剂量大鼠股骨骨痂BMD、BMC数值显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，无明显差异(P>0.05)，说明杜仲中、高剂量组和阳性对照组疗效相当。见表1。

表1 各组大鼠股骨BMD、BMC比较

3.2 各组大鼠骨生长因子比较

与空白组相比，模型组大鼠血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，杜仲中、高剂量大鼠血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组相比，无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平比较 ((x±s，μg·L-1)

3.3 各组大鼠激素及细胞因子水平比较

与空白组相比，模型组大鼠血清E2水平显著降低(P<0.05)，TNF-α及IL-6水平有所升高(P<0.05)；与模型组相比，杜仲中、高剂量大鼠血清TNF-α及IL-6水平显著降低，E2水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，无明显差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组血清E2、TNF-α及IL-6水平比较

4 讨论

OP属于祖国医学“骨痿”范畴，基本病机为年老体衰、肾精亏虚，中医认为其治则当是温补肾阳、填精生髓兼以益气养血。杜仲味甘、微辛，性温，归肝、肾经，具有“补肝肾、强腰膝、坚筋骨”的功效。近年来，通过动物实验发现盐灸杜仲有很好的补肾健骨作用，本实验通过观察大鼠骨生长因子、激素及细胞因子水平变化情况探讨盐灸杜仲防治骨质疏松的作用机理，为中医药临床治疗骨质疏松提供理论基础。

骨密度被WHO推荐为诊断OP的金标准[5]，在一定程度上能反映骨矿物含量。本实验结果显示，模型组BMD、BMC水平较空白组明显降低(P<0.05)，杜仲中、高剂量组大鼠股骨骨痂BMD、BMC较模型组也有显著升高，与阳性对照组无明显差异，这一结果进一步证实了盐炙杜仲能有效提高骨质量，改善全身骨密度，对维甲酸诱导的骨质疏松症有不错的疗效。

骨形态发生蛋白(BMP)转化生长因子(TGF-β)中的一组多功能细胞因子，能诱导间质细胞增殖分化成软骨细胞，为骨折愈合的关键性细胞因子之一。BMP-2在此过程中作用显著，加速间质细胞转化成软骨细胞。IGF-1参与成骨细胞生长、分化及代谢调节过程，能有效促进骨细胞生成、刺激胶原合成从而促进骨基质形成[6]。血管内皮生长因子(VEGF)能够促进骨组织内血管网生成，直接作用于成骨细胞，增加骨细胞ALP活性，刺激成骨细胞分化、改善骨组织内血供从而促进骨形成。本研究结果显示，治疗后，与模型组相比，杜仲中、高剂量组大鼠血清BMP-2、VEGF、TGF-β、IGF-1水平明显升高(P<0.05)，与阳性对照组无明显差异(P>0.05)。这说明在盐炙杜仲作用下，通过提高骨生长因子水平促进血管内皮生长，能有效防止骨质疏松。

在骨代谢过程中，少不了雌激素的参与，它是保持骨质量与骨结构正常的必需激素，能影响成骨及破骨细胞活性、维持骨代谢平衡。有研究[7]表明，IL-6具有来源广及作用途径多的特点，主要通过调节破骨及成骨细胞来参与骨代谢过程，从而提高骨密度。TNF-α是重要的破骨细胞调节因子，通过炎症反应诱导骨分解作用，还可通过促进骨细胞凋亡，从而达到抗骨质疏松的作用。IL-6、TNF-α的产生会促进骨吸收、加重病情发展。本实验结果显示，经治疗后，杜仲中、高剂量组E2水平显著升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α水平显著降低到正常值(P<0.05)，提示杜仲能通过促进雌激素分泌及降低炎症细胞因子水平对骨质疏松大鼠模型产生治疗效果。

综上所述，本实验表明，中、高剂量的盐灸杜仲能促进骨生长因子生成、影响炎症细胞水平，达到治疗骨质疏松的目的，具有可行性。