蛹虫草的优化栽培及其成分分析
2021-01-11王升厚柳叶飞赵洪新赵晓云徐方旭
王 哲 王升厚 柳叶飞 王 泽 赵洪新 赵晓云 徐方旭
(1.沈阳师范大学生命科学学院,辽宁沈阳 110034;2.沈阳师范大学实验教学中心,辽宁沈阳 110034;3.浙江理工大学生命科学与医药学院,浙江杭州 310018;4.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院,辽宁沈阳 110016)
野生蛹虫草主要分布在我国的东北地区及河北、广西等省区,辽宁省在1986年便发现蛹虫草[1],其化学成分和药理作用与冬虫夏草相近,是冬虫夏草的最理想替代品[2]。近年来,蛹虫草经过人工驯化培育,技术手段趋向成熟,已经实现规模化生产。沈阳市是我国最早人工栽培蛹虫草的地区[3],经分析证实,人工培育的蛹虫子实体中含有丰富的:虫草素、腺苷等活性物质,虫草素作为一种核苷类似物,有着广泛的生物学功能,不仅可以作为抗癌的药物[4],还对治疗白血病有显著功效[5],目前开发前景广阔[6]。
1 材料与方法
1.1 试验材料供试菌种的编号为C02,是实验过程中筛选出来的菌种之一,由沈阳市农业科学院食用菌研究所提供。培养基分为3种,即母种培养基、液体菌种培养基和栽培种培养基。
1.2 测定方法
1.2.1 母种制作 (1)将新鲜无芽无病变的马铃薯去皮,切成0.3~0.8 cm的条状,加水煮汁,约10 min后,煮至熟而不烂状,用8层纱布进行过滤。
(2)将滤液定容后加入琼脂粉搅拌均匀,再加入葡萄糖、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、维生素B1等,加热煮沸,分装到试管中。
(3)在121℃的环境中,高压灭菌25 min,灭菌结束温度降至80℃以下,趁热取出试管摆斜面,培养基稍低于试管的2/3处即可(切勿沾到棉塞,防止杂菌滋生),冷却凝固后备用。
(4)接种,将 10种编号为 C01、C02、C03、C04、C05、C06、C07、C08、C09、C10的母种分别继代,用无菌接种铲在母种最前端取黄豆粒大小,接种到新的培养基上,在20℃的环境中避光黑暗培养,空气湿度控制在65%左右,10d后见自然光,共培养15 d,观察其长势及转色情况。
1.2.2 液体菌制作 (1)将玉米粉充分溶于水后,再加热煮沸。
(2)定容后,加入葡萄糖、磷酸二氢钾、无水硫酸镁,蛋白胨、维生素B1碾碎煮沸,搅拌均匀后分装到250 mL的三角瓶中,装液量占三角瓶的1/3~1/2,迅速封口。
(3)装入立式高压灭菌锅中,在123℃的环境中灭菌40 min,冷却后备用。
(4)接种,将剩余8种编号为C02、C03、C05、C06、C07、C08、C09和C10的母种进行液体种接种,在超净工作台上将母种试管取0.5 m3大小的菌块,接种于液体培养基中,温度控制在21℃,摇床频率120 r/min,培养6 d,观察菌球生长速度及菌球是否均匀一致。5
1.2.3 瓶载培养基制作 (1)将14种杂粮(燕麦、小米、高粱米、玉米、糙米、黄豆、荞麦、薏米、绿豆、红豆、黑豆、黑米、大米和小麦),分别装入750 mL的罐头瓶中,每瓶35 g。
(2)按常见小麦培养基的料水比1∶1.6加清水,即56 mL/瓶,封口。
(3)水平装入立式高压灭菌锅中,在123℃的环境中灭菌2 h,待冷却后备用。
(4)在超净工作台上接种,取8种液体菌种,用无菌水将菌种稀释,稀释倍数为1∶5,每瓶接种稀释液5 mL。
1.2.4 出草管理 (1)出草室消毒。发菌前,对出菇室进行消毒。1 m3空间用15 mL的40%甲醛加入14 g高锰酸钾消毒45 min,开窗通风24 h后可进入发菌。
(2)发菌温度保持在18℃,当菌种萌发后升至20℃,将空气相对湿度控制在60%左右,避光黑暗培养7 d。
(3)当菌丝长满料面、穿透底面近2/3后,见光培养,每天光照18~20 h,白天散射自然光,夜晚采用日光灯补充光照。温度控制在20℃,空气湿度控制在80%,每天通风0.5 h。当原基出现后,将瓶口塑料膜封口膜扎眼通氧,加强瓶内外气体交换,温度保持在22℃,待草芽长出3~4 cm后补充水分,空气湿度调为85%,每天通风2~3次,每次30~50 min,连续培养60 d左右,观察子实体的长势及商品性。收获后,将其在55℃的恒温箱中干燥至恒重,干重称重,并计算生物转化率。
1.2.5 优化料水比 当料水比为1∶1.6时,观察14种碳源的发菌情况、转色情况、原基形成情况等,观察结束后记录其长势情况,并对不适宜的料水比进行调整,直至调整到适宜蛹虫草生长为止。
2 结果与分析
2.1 发菌转色结果由图1可知,培养基F发菌比较缓慢,见光后边缘轻微转色,料面中心内不发菌;培养基I和培养基J不转色;培养基K仅边缘发菌,见光转色不均匀,菌丝不吃料。图2发菌均匀,见光转色快,菌丝吃料。
图1 未发菌及发菌不转色的碳源培养基
图2 发菌及转色正常的碳源培养基
2.2 料水比优化栽培试验结果通过多次栽培,观察发菌、转色及原基情况,根据实际情况调节料水比,得到表1。
表1 料水比调节表
由表1可知,第一批料水比为1∶1.6,发现培养基F、I、J、K未发菌或发菌少,故直接淘汰,其他除培养基D水分偏少外,其余水分都偏多;根据第一批栽培结果进行料水比调整,直至得到最适料水比。通过图3可知,菌丝要平铺料面,无气生菌丝及厚菌皮,培养基不能太干燥,发菌后不能露出杂粮颗粒等。
图3 优化料水比后发菌情况
3 结语
通过优化试验得到适宜的料水比:A为1∶1.4,B为1∶1.1,C为1∶1.4,D为1∶1.7,E为1∶1.1,G为1∶1.4,H为1∶1.6,L为1∶1.1,M为1∶1.1,CK为1∶1.6。研究结果能够为虫草产业发展奠定基础。