白细胞介素-1受体拮抗剂等位基因2串联重复多态性与原发性膝骨关节炎易感性的关系

申成凯，赵海军，孙代同，吕成昱，赵希春

1青岛市胶州中心医院关节创伤外科，山东 青岛 266300；2青岛大学附属医院关节外科

骨关节炎（OA）是一种以进行性关节疼痛、畸形及其功能障碍、关节软骨破坏等为特征的关节疾病。OA的发生是多种危险因素共同参与的复杂过程，包括遗传因素、炎症、激素、年龄、肥胖、生活习惯等。流行病学调查显示，OA发生不但与环境及体内炎性因子的参与有关，还与种族的遗传差异相关［1］。研究［2］证实，OA发生存在相关的易感基因，而且有较强的遗传倾向。白细胞介素-1β（IL-1β）的表达与种族遗传有关已被国内外很多研究证实，其基因位点的多态性在不同的种族呈现不同的分布频率。IL-1β是前炎症反应的中心介质，在炎症反应过程中起重要作用，通过其调控基因白细胞介素-1B（IL-1B）基因多态性影响IL-1β相关基因的转录及蛋白表达，使IL-1β在体内的水平发生改变，从而改变OA的发生率［3］，而体内IL-1活性在很大程度上取决于白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1ra）的调控。现已发现，白细胞介素-1受体拮抗剂等位基因2（IL-1RN*2）与许多慢性炎症及自身免疫疾病相关，推测可能与携带者体内IL-1ra水平发生错误表达有关［4］。本研究通过分析IL-1RN*2串联重复多态性与胶东地区原发性膝关节骨关节炎（PKOA）患者易感性的关系，探索IL-1RN基因在PKOA发病过程中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年3月—2021年3月潍坊医学院附属胶州中心医院收治的PKOA患者244例（观察组），男58例，女186例；年龄52～74（58.38±5.65）岁；BMI 20.32～29.46（26.57±3.24）kg/m2。诊断标准：符合美国风湿病学会PKOA诊断标准［5］。纳入标准：①近1个月大多数时间膝关节疼痛；②X线片的Kellgren/Lawrence评分［6］>Ⅱ级；③膝关节晨僵≤30 min；④有骨摩擦音或膝关节骨性膨大。排除标准：①BMI≥30 kg/m2；②既往有膝关节外伤、手术史造成的创伤性膝关节炎；③既往有膝关节慢性感染、免疫系统疾病、结缔组织疾病等病史；④实验室检查CRP、血沉高于正常的3倍。另选233例健康查体者作对照（对照组），男54例，女179例；年龄45～65（55.70±13.5）岁；BMI 18.02～29.08（25.32±1.29）kg/m2；X线检查证实无PKOA表现。消除人群研究中的地域及种族影响，所有的研究对象均来自于胶东地区汉族人群。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。本研究经青岛市胶州中心医院伦理委员会认可，所有受试对象均签署实验知情同意书。

1.2 IL-1RN基因多态性分析 使用非离心柱型血液基因组DNA提取系统试剂盒（TIANGEN BIO‐TECH），通过EDTA抗凝的外周血白细胞中提取所有研究对象的DNA。IL-1RN基因多态性表现为可变数目的串联重复序列（VNTR），其重复序列长为86 bp，人类可有5种不同的重复组合等位基因，分别是：2个重复体IL-1RN*2，240 bp；3个重复体ILIRN*4，325 bp；4个重复体IL-1RN*1，410 bp：5个重复体IL-1 RN*3，500 bp和6个重复体IL-1 RN*5，595 bp；其中3、5、6重复体的发生率极低。IL-1RN VNTR［7］：5’CTCAGCAACACTCCTAT3’，5’TCCTG‐GTCTGCAGGTAA3’。PCR扩增条件：94℃先预变性5 min，然后按97℃变性10 s，58℃退火30 s，70℃延伸35 s，33个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物经过2.0%琼脂糖凝胶80 V电泳100 min后，在紫外灯下根据电泳结果对研究对象行基因型分类。IL-1RN是插入/缺失基因多态性，扩增PCR产物片段长度可变，本实验中根据串联重复不同分割成为240、325、410、500 bp的4个片段，形成4种基因型，电泳结果中只有410 bp片段的为1/1基因型，电泳结果中只有240 bp片段的为2/2基因型，电泳结果同时出现410 bp和240 bp两条片段的为1/2基因型，电泳结果同时出现410 bp和325 bp两条片段的1/4基因型。在我们的研究对象中1/1基因型的数量最多，所以将1/1基因型定位野生型（未突变型），在国外的研究中发现IL-1RN*2基因与很多疾病的易感性相关，故将含有2个重复体IL-1RN*2基因作为变异型（突变型）来研究。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件和Hap‐loview软件。计数资料比较采用χ2检验。用Haplo‐view软件对不同基因型频率分布特征进行哈代－温伯格平衡检验，分析基因型分布是否符合遗传平衡定律。用非条件Logistic回归分析两组之间的单核苷酸位点基因型出现频率的分布，通过计算各个基因型的比值比（OR）、95%可信区间（CI）和P值，来评估哪种基因发生PKOA的风险高。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 遗传平衡定律分析结果 基因型数目的观察值与该位点上全部基因型频率分布在符合Hardy-Weinberg平衡时的期望值之间的吻合程度，该研究观察组和对照组在IL-1RN的基因型分布的观察值和期望值之间的差异无统计学意义（P>0.05），研究对象的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 IL-1RN的基因多态性分析结果 通过聚合酶链反应和限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLR）在我们所有的研究对象中一共发现3种等位基因和4种基因型，其中1/1基因型仅有一条410 bp的片段，1/2型 为410 bp和240 bp两条片段，1/4型为410 bp和325 bp两条片段，2/2型为一条240 bp的片段。

2.3 两组IL-1RN基因型、等位基因频率比较 观察组基因型1/1 176例（72.1%）、1/2 53例（21.7%）、2/2 12例（4.90%）、1/4 3例（1.30%），对照组分别为169例（72.5%）、50例（21.5%）、10例（4.30%）、4例（1.70%），两组比较差异无统计学意义，P>0.05。观察组等位基因1：408例（83.6%）、等位基因2：77例（15.8%）、等位基因4：3例（0.6%），对照组分别为392例（84.1%）、70例（15.0%）、4例（0.9%），两组比较差异无统计学意义，P>0.05。风险性非条件Logistic回归分析发现，IL-1RN基因变异型（1/2和2/2）发生PKOA的风险是非变异基因型（1/1+1/3+1/4）的1.955倍（OR=1.955，95%CI=0.635～5.437）；其中携带变异IL-1RN*2基因位点发生PKOA的风险是IL-1RN*1基因位点的1.589倍（OR=1.589，95%CI=0.791～3.016）。

3 讨论

OA是一种与年龄相关的退行性疾病，主要发生在中老年患者。最近实验表明，OA是一种主要影响大的负重关节的炎症性疾病，如髋关节和膝关节［8］。OA病理过程包括关节软骨破坏，软骨下骨磨损，以及异常的重塑导致关节疼痛、僵硬、肿胀，最终导致关节功能障碍［9］。文献［10-12］报道，年龄、性别（女性居多）、肥胖、营养不良、关节严重损伤、关节力线改变、基因遗传因素也对OA的发病起主要决定因素。然而研究［13］表明，膝关节OA不是一种单纯的老化过程，而是遗传度较高的疾病。

IL-1β是PKOA遗传因素研究的热门致炎因子之一，其调控基因IL-1B的基因多态性与PKOA之间的相关性研究缺乏统一的结论，先前我们研究了一些IL-1B基因与骨性关节炎的发病机制的相关性，发现PKOA的易感与IL-1B基因的某些位点多态性相关。KAARVATN等［14］通过对兔骨性关节炎模型的研究，发现IL-1β细胞因子的过度表达破坏兔的关节组织，诱导关节炎的发生，但通过IL-1β抑制剂靶向结合IL-1受体，可抑制IL-1β的作用，降低软骨基质降解，阻止软骨细胞被破坏，故认为IL-1β很可能在OA发病过程中过度表达，从而提出了该细胞因子可作为临床早期诊断膝关节OA的一项指标［15］。IL-1ra能抑制IL-1β发挥作用，从而保护软骨细胞，减轻临床症状的作用，而IL-1ra/IL-1β的比率失衡与软骨破坏程度相符，是PKOA形成的关键因素［16］。在膝关节OA发病过程中，各细胞因子间是相互作用、相互调节的，细胞因子对OA的影响是一个非常复杂的过程，细胞因子基因多态性的不定向表达，影响其在关节液中的浓度，进而影响软骨细胞的代谢，造成PKOA发生概率发生变化。研究［17-18］发现，IL-RN携带两种不同的基因位点多态性对KOA有保护作用。

在我们之前研究中发现PKOA患者血清IL-1β水平明显高于正常人水平。TOWNE等［19］发现，IL-1β水平与PKOA软骨的破坏程度呈显著正相关，IL-1β水平的高低可影响PKOA的进展过程。鲍亮教授也得出同样的结论，提出关节液与血清中的IL-1β水平的可间接反映KOA的疾病严重程度，由此可见血清IL-1β的水平与PKOA的发生具有一定的相关性。由于PKOA的临床检查在时间上滞后于膝关节炎病变的发展，所以早诊断、早治疗对于PKOA的预防和治疗意义尤为重要。既然IL-1ra可以通过竞争性的与IL-1受体结合抑制IL-1β发挥作用，是否IL-1ra的水平是也与PKOA的易感性相关。通过该实验研究寻找IL-1RN（VNTR）的哪种基因型可对PKOA有保护作用，在本实验中发现IL-1RN（VNTR）的四种基因型，未发现1/3基因型，1/1基因型占的比例最多，在观察组176例（72.1%），在对照组169例（72.5%），变异基因型1/2和2/2在观察组65例（26.6%），在对照组60例（25.8%）。IL-1RN基因变异型（1/2和2/2）发生膝关节OA的风险系数是对照组的1.955倍，但是差异缺乏统计学意义。在基因位点分布中，变异等位基因2的研究对象为在观察组77例（15.8%），在对照组为70例（15.0%），变异等位基因2发生PKOA的概率是野生等位基因1的1.589倍，差异仍然无统计数意义，该实验结果显示影响IL-1β血清水平的IL-1RN*2串联重复多态性与胶东地区的PKOA的高发病率无明显相关性。国内外关于IL-1RN等位基因与PKOA的相关性研究比较少，而且结论不一，这可能与选择样本的地域差异、种族差异，诊断标准等原因相关，下一步需要我们收集更多的数据，更详细的资料，得出更为准确的结论。

一项关于髋关节和膝关节的OA病例对照研究的Meta分析指出，目前大量的研究只是增加了现有结论的不确定性，可能排除了一些低风险关联，但是在种群差异之间，共同的多态性这种情况可能很少见，也可能根本不存在［20］。OA是有多种炎性因子共同参与的一种复杂性疾病，任何一个细胞因子的等位基因变异都有可能对OA的形成产生影响，等位基因分布在多样化的人群中，每个亚群体都拥有单一的或多个风险因素，因此，PKOA的形成存在多种不确定的风险因素，要评估PKOA易感性的遗传因素，需要在尽可能多的人群中的寻找易感候选基因，同时还需排除影响PKOA发病机制的其他风险因素。IL-1RN的基因多态性在PKOA发生过程中的未知的特异性影响，有待进一步的探究。由于PKOA的确切病因和发病机制仍不太清楚，因此对其治疗仍难以达到理想的效果，目前国内外都在为保膝积极寻找治疗方案，假如我们能发现PKOA的遗传易感基因，从而降低PFOA的发生率，这可能比探索膝关节OA的手术治疗方案更有意义。

总之，PKOA患者体内IL-1β炎性因子的血清水平明显升高，但影响IL-1β血清水平的IL-1RN*2基因的串联重复多态性与胶东地区PKOA高发病率无明显相关性。