水果香气物质分析研究进展

肖作兵，蒋新一，牛云蔚

(上海应用技术大学 香料香精化妆品学部，上海 201418)

水果的风味、外观颜色以及营养价值是其关键的品质特性，香气是影响消费者偏好的主要因素之一[1]。水果中的挥发性香气物质种类繁多，主要由酯、醇、醛、酮、内酯、萜类组成[2]，但微量成分也可能起着关键作用，如微量的硫化物与其他化合物结合给热带水果带来了诱人的热带风味[3]，这说明了在众多挥发性物质之间找到关键香气物质及分析可能存在的相互作用对香气的研究意义重大。

本文从挥发性游离态香气和键合态香气物质两个角度分别介绍了目前水果香气物质的研究进展，并根据水果的特点概述了水果香气物质提取技术的选择，分析了主要方法的优缺点，以及鉴定水果关键香气物质的方法。为了更好地全面了解香气物质的相互作用，在香气感知角度上，阐述了香气物质协同作用和基质- 香气物质相互作用对整体香气的影响，为水果及其加工产品改善香气以及提高质量品质提供了理论依据，同时为研究水果香气物质及其变化规律提供了新的思路。

1 水果香气存在形态与提取鉴定

1.1 水果香气物质的存在形态

1.1.1游离态香气物质研究

水果中芳香物质主要以游离态和键合态形式存在，其中游离态香气物质具有挥发性，能够直接被感知。游离态挥发性物质主要用来呈现水果中的香气。目前对于水果中的游离态挥发性香气物质对比研究集中在同一水果的不同品种、不同部分(果皮、果汁、果肉等)导致不同香气差异分析上，为水果的进一步加工利用提供研究依据[4]。

同时，许多因素影响着游离态挥发性成分，包括遗传、成熟度、环境条件、收获后加工和储存等，这些因素决定了果实的特性和感知品质。目前国内外大多围绕着成熟度(不同生长阶段)和储存加工方式展开。Dou等[5]研究了收获季节对香蕉挥发性香气物质的研究，研究发现三月份收获的香蕉具有更多的挥发性香气物质，为产品采收提供了理论依据。橘子[6]、杨梅[7]、桃子[8]等水果也展开了成熟度香气变化规律相关研究。

水果在加工过程中不可避免的会导致游离态香气物质的损失或可能产生异味，不同的储存方式也会对水果香气特征有很大影响[9]。郭艳峰等[10]分析了不同干燥方式对百香果挥发性风味成分的影响，发现真空冷冻干燥基本能够保持原有的风味。张义[11]研究了不同储藏温度、时间对龙眼汁香气物质的影响，结果表明龙眼汁更适合低温短时储藏。

1.1.2键合态香气物质研究

近几十年来，游离挥发性物质的研究取得了很大进展。然而，糖苷结合的键合态芳香化合物受到的重视远少于游离芳香化合物。键合态香气物质也称风味前体物，是一类不具有挥发性的物质，其含量远超于游离态挥发物，一般与水果中的糖类物质通过糖苷键结合，以糖苷形式存在，嗅觉不容易感知[12]。在果实成熟过程中，键合态挥发性物质的糖苷键在水解和高温等条件下可能发生断裂[13]，以游离态形式被释放进而被感知，从而增强整体香气和改变水果香气，是水果芳香的潜在香气来源。

目前，已有对水果键合态香气物质与果实成熟规律联系起来的研究报道，包括猕猴桃[14]、葡萄[15]、桃[16]、草莓[17]等。

为解决水果及其产品在加工或储藏过程中的香气损失，提高产品质量、保持产品香气完整，一般会添加食用香精，但得到的产品香气缺乏天然感，而通过酶解[18]或酸解[19]水果中的糖苷香气前体物质释放香气能够获得天然的香气来改善产品香气、增强品质。目前，该方法已成功应用于橙汁[20-21]、刺梨汁[22]、猕猴桃酒[23]等水果产品增香上。因此，键合态香气物质释放技术已经成为增强或维持水果及其加工副产品的香气质量的有效生物技术手段。

1.2 水果香气物质的提取与鉴定

1.2.1水果香气物质的提取技术

水果基质复杂，有些对风味起关键作用的成分浓度低、不稳定，只有选择合适的萃取方法，才能准确高效地分析出水果中的挥发性成分。

新鲜水果的独特风味会因加热而改变。因此，在提取新鲜水果风味物质的过程中应尽可能限制加热处理，不破坏水果的天然风味。而大多数分离和浓缩技术需要不同程度的热处理，这会对分析结果带来较大影响。目前从水果中分离和富集挥发性成分的行业标准是溶剂辅助风味蒸发(solvent-assisted flavor evaporation,SAFE)，该方法比其他蒸馏技术更加受到研究人员的青睐，因为它限制了热效应，该方法已广泛使用在西瓜[24]、覆盆子[25]、番茄[26]、芒果[27]等水果富集挥发性物质的研究上。SAFE的提取率很高，包括极性、挥发性较小的风味成分，这些成分对许多风味类型都很重要，因此提取物的香气特征与自然香气十分相似，但提取所需的样品量大且操作复杂、耗时长。

顶空- 固相微萃取(headspace-solid phase microextraction,HS-SPME)作为一种新的提取方法已被广泛用于水果香气物质的提取。与传统的萃取技术相比，SPME具有高灵敏度、低成本、无溶剂、操作简单的特点[28]，但HS-SPME分析结果受许多因素的影响，如纤维涂层、提取时间、样品大小等[29]。

静态顶空(static headspace,S-HS)比SPME更简单，更快，并且可以实现自动化，但是其灵敏度较低。

从考虑基质效应角度，蒸馏和溶剂萃取技术并不适合新鲜水果的风味物质提取，因为它们破坏了基质效应。而SPME的萃取严格取决于分析物在样品基质、顶空气体和纤维涂层之间的分配系数。同时，顶空技术允许检测高挥发性化合物，并且考虑了从基质中的动态释放。SPME提出后不久,在此基础上报道了搅拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction,SBSE)技术，它具有与SPME相同的优势，但由于使用了更多的固定相，因此其灵敏度提高了约100倍且具有更好的萃取能力[30]，在液体果汁的风味物质研究中使用率较高。

目前很多文献研究了对比多种提取水果挥发性物质方法的不同，如Barba等[31]使用了SPME、SBSE、SAFE等方法对比了提取果汁中的挥发性成分，结果表明：SAFE得到可以鉴定的化合物最多，SBSE次之，SPME最少。

SPME能有效地萃取醛、醇和酮[32]，而SAFE萃取硫化合物的效率更高[33]。当研究相对分子质量较大，更疏水的分子(例如游离脂肪酸和内酯)时，蒸馏和溶剂萃取最为有效[34]。任何提取技术都不能对样品挥发性物质进行完整的分析，但是它们可以相互补充。

1.2.2关键香气物质鉴定技术

区别关键香气物质与其他挥发性化合物也是一个重要的问题，因为并非所有挥发性化合物都存在可感知的气味。尽管通过对水果的挥发性成分进行仪器分析，可以检测到数百种挥发性物质，能够直观地了解其香气成分，但它们对气味的贡献通常与它们的含量没有直接关系，挥发物含量高的物质可能不会在香气中起主要作用，只有极少数会对总体风味有实质性影响。这些少数重要风味化合物即水果的香气活性成分或关键香气物质。

目前通过气相色谱- 嗅觉辨别法(gas chromatography-olfactometry,GC-O)筛选，使用香气活性值(odor activity value,OAV)计算来确定水果中关键香气成分已成为有力的工具。

为解决香气强度无法评价的问题，研究人员开发了香气萃取稀释分析法，时间强度法和检测频率法等稀释方法来配合GC-O使用。

同样，仅仅通过上述方法也不能够全面评价香气物质对风味的贡献，如目前较为广泛使用的香气萃取稀释分析法只能表现出香气相对强度，并没有考虑到基质效应[35-36]。所以引出了香气活性值的概念，它等于食物中挥发性成分的浓度与其在食物中检测阈值的比值，能够分析某个香气物质对整体香气的贡献，通常我们把OAV≥1的香气物质作为对整体香气有贡献的成分且OAV值越大，该成分对整体香气的贡献就越大。它的应用在食品领域得到越来越多的推广[37]，且已鉴定出桑果[38]、杨梅[39]、哈密瓜[40]等水果的关键香气物质。

但OAV的计算并未考虑到香气物质之间的协同作用，为解决局限性，目前食品风味研究加入了香气重组、遗漏实验：通过重现特征香气轮廓，检验筛选结果来验证关键香气物质的有效性与准确性。Munafo等[41]通过香气萃取稀释分析法,OAV计算得到芒果中24种关键香气物质，并首次使用香气重组、遗漏实验法来验证芒果的香气，最终确认了15种香气物质是芒果的关键香气物质。该方法已被研究人员应用于苹果[42]、蔓越莓[43]、柑桔[44]、榴莲[45]等水果关键香气物质分析上，还应用于鉴定加工后水果的异味物质[46]等领域。

2 水果香气物质的感知相互作用

仅了解挥发性成分和浓度不足以完全解释水果的整体风味。而挥发性香气物质之间的相互作用，香气物质与基质之间的相互作用都可能影响水果香气成分的挥发性、香气释放以及整体感知的香气强度与质量。对香气感知相互作用的分析是研究水果复杂香气物质的重要组成部分。

2.1 香气物质之间的相互作用

香气化合物对天然产品总体香气的贡献并不等于是挥发性化合物的总和。影响整体香气的不仅是OAV大于1的化合物，不能忽略OAV小于1的挥发性化合物对整体香气和化合物之间相互作用的贡献[47]。有研究表明香气化合物对总香气的贡献取决于其OAV。但是，应用OAV评估香气化合物的作用是基于这样的假设：香气化合物之间没有相互作用[48]。实际上，混合物中的香气化合物之间存在复杂的感知相互作用，无法从每种挥发物的比例和浓度中预先确定系统的总体香气。香气挥发物彼此相互作用，以相互促进或抑制某些总体结果，因此引出了很多香气协同作用研究。目前，研究香气化学物质之间相互作用的方法主要有阈值法[49]、S曲线法[50]、OAV法[51]和σ-τ图法[52]。

同时，一些研究已经试图解决水果中香气化合物之间的相互作用。陈佳莹[53]通过S曲线法和σ-τ图法对绿橙中香气物质之间的相互作用进行研究，结果表明：在所有协同的混合物中，大多数二元混合物中的单一化合物一个是超阈值浓度水平和一个近似阈值浓度水平，同时说明不是只有OAV大于1的物质才是关键香气物质，近似阈值浓度水平的香气物质也会通过与其他香气物质相互作用后对混合物的风味产生一定的影响。进一步的，王若琳[54]使用上述相同方法对刺梨中关键香韵(酸香、木香、果香、青香)之间的相互作用进行研究，结果显示：果香和酸香、果香和青香、酸香和木香、酸香和青香的组合有加成作用效果，木香和青香组合为掩盖作用效果。

酯类是苹果中主要的挥发性物质，但是酯类之间的相互作用研究却很少。在一项研究中[47]，作者首先筛选出红苹果果汁关键香气化合物，并选择4种化合物(2-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯)作为研究对象。利用S曲线法研究苹果汁中化合物可能发生的相互作用。结果显示，与不添加这4种挥发性化合物的溶液相比，添加后溶液的感官阈值降低，甜香、脂蜡香、果香和花香香韵的香气强度增强，酸香香韵的香气强度降低，以此推断出这4种化合物与苹果汁中其他香气物质发生了相互作用。此外，研究还通过σ-τ图法研究了添加单一化合物(2-甲基丁酸乙酯)后对香韵的影响，来进一步证实香气化合物之间发生的相互作用。得出结论：当添加低于阈值浓度的挥发性化合物时，对原溶液化合物具有部分加成或协同作用。笔者研究团队[55]也从苹果汁的关键香气物质中选择了6种酯类物质，通过气味阈值、香气强度、电子鼻等方法来评估不同类型的酯类化合物之间的相互作用。对于某些具有相似结构和香气的酯类化合物来说，得出它们之间可能发生加成或协同作用的结论。同时指出，不是所有具有相似结构和香气的物质都符合这个结论，这也进一步证明香气化合物之间复杂的相互作用。

挥发性含硫化合物广泛存在于水果中，是水果中重要的香气化合物，尤其在热带水果中，尽管含硫化合物的浓度很低，但因其阈值低，所以对香气的贡献很大。笔者研究团队[56]从芒果中挑选了5种含硫化合物来研究相互作用，通过Feller添加模型、OAV和向量模型研究表明它们之间大多表现出掩蔽作用。

2.2 基质与香气物质的相互作用

香气协同研究解决了忽略OAV小于1的挥发性香气物质对整体香气的贡献的问题，基质与香气物质相互作用研究是为了检验OAV大于1的化合物是否对整体香气有贡献。

水果基质是由挥发性和非挥发性物质组成的复杂的多组分系统，除了香气物质之间的相互作用，香气物质与非挥发性基质组分的相互作用也会改变食品上方顶空的挥发度和浓度，这些顶空浓度的变化会导致感知香气强度的差异。食物基质的组成会通过影响风味化合物的释放，进而影响阈值。人们在嗅探食物时，香气物质必须从食物基质中释放到空气中，然后穿过鼻腔到达嗅觉黏膜，香气物质从食物基质中的释放是鼻前和鼻后感知的起点。

虽然OAV考虑了香气物质与基质的相互作用，但目前OAV的计算依赖于使用香气物质在水基质中的阈值[57-59]，原因在于测量阈值的工作量较大且缺乏在其他食品基质中气味阈值的测定结果参考，此外，水是无味的基质而大部分水果基质中都含有气味，会影响阈值的测量。但是测量水中的气味阈值并没有考虑到食物基质中挥发性和非挥发性化合物之间可能发生的复杂相互作用。对于大多数水果中的挥发性物质，已经在水溶液中确定了气味阈值，而在真实基质中的气味阈值测定结果报道很少。

Plotto等[59]测定了橙汁中的萜烯和醛的鼻前阈值，比水中的阈值高15倍(柠檬酸、己醛)至200倍以上(β-蒎烯、柠檬烯)，同时测定了橙汁中酯类化合物的鼻前阈值[58]，可以比水中高2倍(丁酸甲酯)至30倍(丙酸乙酯)，这些在实质上都会影响OAV计算结果的准确性。不同类型果汁的香气活性物质不同，并且香气物质的阈值在不同基质中存在差异。所以，不应将一种食物基质中确定的阈值转化到另一种食物系统中使用。当将某香气物质的浓度与不适当的阈值进行比较时，可能导致食品中香气物质的实际效力被低估或高估。

食物基质主要是由大分子组成的，如脂质、蛋白质、碳水化合物和多酚等。这些大分子与芳香化合物(小分子)发生特定的、有选择性的相互作用来影响人们对芳香的感知。而对于另一部分较小的分子，例如单糖等，对某些挥发性化合物吸附或有“盐析”作用[60]。

不同程度的相互作用影响，受香气物质固有的理化性质[61](疏水性、亲水性和挥发性)、基质的组成(性质、含量)、流变学性质[62]以及最终的环境条件(温度、pH值)的影响。非挥发性化合物根据其分子质量或特定的化学性质可以改变芳香化合物在基质和气相之间的分配，从而影响芳香化合物在鼻腔中的释放[63]，进而影响消费者对食品的接受度。为了被感知，芳香化合物必须从食物基质转移到气相且高度依赖于它们与食物基质中存在的非挥发性化合物的相互作用。Bezman等[64]发现番茄基质减少了新鲜番茄关键特征香气的释放。

不同挥发性化合物及其浓度之间的平衡决定了水果及其产品的整体风味，而水果及副产品在加工过程中会改变特征性挥发性物质[65-66]，或改变质构，质构的改变对整体香气会有影响。

糖作为小分子基质，对水果产品质量的影响已成为许多研究的主题。Pan等[67]研究了蔗糖，葡萄糖和果糖对新鲜芒果汁中活性香气化合物释放的影响，通过傅立叶变换红外和等温滴定热分析表明：随着糖含量增加，新鲜果汁中的香气释放会根据香气物质的结构而改变且释放变化主要是由熵驱动的。Baldwin等[68]使用除臭番茄泥评估了番茄的香气发现：添加糖与各种香气化合物相互作用通常会降低对青香的感知，同时增强与成熟，热带和番茄相关风味的感知。

目前基质与香气化合物相互作用研究的文献在水果及其产品体系下研究较少。多酚是水果中的重要化合物，能够结合芳香化合物，其相互作用已在酒中进行大量研究。Guo等[69]研究了多酚对苹果酒中香气物质释放的影响，酚类化合物浓度的增加显著影响大多数芳香化合物的头部空间浓度。研究发现：3种多酚导致大多数疏水香气化合物的挥发性降低。

同时，Sabatini等[70]发现挥发性物质在橄榄果基质和盐水培养基中的分配有很大不同。大多数挥发性物质对水果基质的亲和力主要取决于分子的化学特性(链长和分支，极性或非极性基团等)，还取决于“盐析”效应。

3 展 望

水果香气物质分析一直受到行业的密切关注，分析仪器的进步及方法的扩展使得人们对水果香气物质有了进一步的认识，但目前在提取水果挥发性香气物质大多使用单一的方法，这使得不能够全面富集物质，在前处理中应采用多种提取方式，互相参考分析结果使得结论更加准确。分析挥发性物质的贡献时，不能忽略某些微量成分对整体香气的关键作用，这使得提高痕量成分检测技术的准确性、灵敏度至关重要，同时，仅分析单一因素(如成熟度)对水果香气的影响，会缺乏对水果及其产品香气的进一步认识，应将综合因素相结合进行研究。

键合态香气物质是水果重要的芳香潜力物质，但因工业提取成本高昂，阻碍了糖苷前体优化产品质量的能力。未来的研究应该提高对糖苷水解机制的理解，并提高量化能力。此外，还需要进行感官研究，以确定增加糖苷水解的步骤是否会对香气产生显著差异。同时，如何控制增香的强度，调控增香方向也是一个重要课题。

另外水果挥发性成分组成复杂，这些香气成分与特定香气之间具有复杂的相互作用，在研究水果挥发性成分在复杂基质中的行为时，目前研究人员仅以两元或三元混合物为研究对象，并在理想体系下研究了不同浓度，配比条件下的阈值变化及其对香气强度的影响，进而阐明了两者之间可能的协同作用，没有考虑在不同复杂基质下对香气协同的影响。同时，在研究基质与香气物质作用时大多使用模拟简单的理想体系，而基于单个成分的结果并不能完全说明真实食品的香气释放情况，需要对模拟基质进行完善或使用真实基质。

此外，如何通过水果香气分析调控风味、通过感知相互作用掩蔽水果加工产品异味物质，模拟水果风味在口腔中的释放，鼻后香气检测及其相互感知作用也是未来水果香气研究的重点。