海源性抗冻蛋白对畜禽精子冷冻损伤的保护作用及其机制

衡诺，郭勇，陈余，王梁，盛熙晖，王相国，邢凯，倪和民，齐晓龙*

（1.北京农学院动物科学技术学院，北京102206；2.北京市畜牧总站，北京100107）

抗冻蛋白（antifreeze proteins,AFPs），又称冰结合蛋白（ice-binding protein, IBP），最初是在极地的鱼类中发现的一类抗冻物质[1]。研究表明，AFPs 通过与冰结合的形式抑制冰晶的生长和冰的再结晶[2-3]。在鱼类、甲壳类、微藻和细菌中均有关于AFPs 存在的报道[4-7]。AFPs 因其独特的生物学特性，可使体内含有AFPs 的生物在低于冰点的温度条件下生存。AFPs 作为一种潜在冷冻保护剂引起了人们广泛的研究兴趣。本文简述了AFPs 的生物学特性，AFPs 对于精子冷冻损伤的保护作用，分析了AFPs 在冷冻保存中的作用机制，旨在为进一步研究AFPs 作为一种潜在的精子冷冻保护剂提供理论基础。

1 AFPs 的生物学特性

1.1 AFPs 的热滞性

热滞性（thermal hysteresis activity,THA）、抑制冰再结晶（ice recrystallization inhibition, IRI）以及AFPs与细胞膜的相互作用是AFPs在抗冷冻损伤中所表现出的3种特性[8]。其中，热滞效应和抑制冰再结晶在抗冻保护中起主要作用。热滞效应指溶液冰点和熔点在温度上的差异。RAYMOND 等于1977年首次提出了AFPs吸附抑制假说[9]：AFPs分子与生长的冰晶表面相结合，抑制外周水分子融入AFPs分子结合的冰晶表面；冰晶在没有结合AFPs分子的冰面上继续生长，最终达到一个临界半径，冰晶生长受到显著抑制。之后，DUMAN[10]和VENKETESH等[11]对AFPs 吸附抑制假说进行了修正。在冷冻过程中，AFPs 会倾向于吸附在冰晶的一个或多个平面上，通过与冰晶结合抑制其二次成核，从而改变冰晶的形状和大小，在这一过程中伴随着热滞。热滞是由于溶液冰点低于平衡熔点导致冰点滞后和熔化滞后共同形成的。在抗冻方面，热滞主要通过降低冰点来提高生物在寒冷条件下的生存能力。吸附抑制假说不可逆结合的概念表明，AFPs和冰晶的不可逆结合与AFPs的活性和浓度没有相关性。然而，研究表明，热滞效应与AFPs 浓度有关[12]。此外，不同类型AFPs在等摩尔浓度下会产生不同的热滞值[13]。

研究表明，AFPs 与冰晶的结合具有不可逆性[14]。当溶液温度处于热滞间隔这一温度区间时，溶液中AFPs 会与冰晶的特定平面发生不可逆的结合，由于不同AFPs的冰晶结合面不同，导致最终形成的冰晶形态存在差异[15-18]。这种差异与AFPs 的类型有关。不同AFPs 与冰晶结合的位面具有特殊性[15]，如：中等活性AFPs与椎体平面结合，而高活性AFPs与冰晶的基面结合[7,17-18]。

1.2 AFPs 抑制冰再结晶

抑制冰再结晶（IRI）被认为是抗冻蛋白AFPs在冷冻保存条件下发挥主要功能的特性[19-20]。在溶液达到冰点时，起初大量小冰晶在细胞外形成，伴随着时间的推移较大冰晶有增大的趋势，而较小冰晶则逐渐消失，这一热力学现象称为冰再结晶[21]。冰再结晶过程中大冰晶的形成不利于冷冻保存细胞以及寒冷条件下生物的生存。一方面，在冷冻条件下细胞外大冰晶的形成会对细胞膜造成机械损伤，使细胞破裂后胞质外流。另一方面，在冷冻条件下细胞内溶液浓度大，冰晶首先在细胞外形成，细胞内形成过冷溶液，随着细胞外冰晶的逐渐增大，胞外溶液浓度逐渐升高造成细胞脱水。AFPs 可抑制低温状态下的冰再结晶过程，与热滞活性相同，这种生物学特性源于AFPs 与冰晶的不可逆结合。但在冷冻状态下IRI与冰晶的作用机制尚不明确。抑制冰再结晶过程通常发生在寒冷条件下生存的生物体内，以保护细胞组织免受冰晶的伤寒。另外，一些海洋性细菌和藻类在冷冻过程中通过向体外分泌AFPs 使外周环境稳定，从而抑制周围冰晶对生物体的损伤[22]。目前，IRI被认为可保护细胞膜免受冰晶造成的机械损伤[23-25]。然而，有研究表明，在冷冻保存中添加AFPs 破坏了细胞膜的完整性，并且随着冷冻保护液中添加的AFPs 浓度的升高，解冻后细胞活力显著下降[26-28]。这可能是由于AFPs的添加导致冷冻状态下细胞外的冰晶生长被抑制，最终形成针状小冰晶而造成细胞膜的机械损伤[27]。

1.3 AFPs 与细胞膜相互作用

AFPs 与细胞膜的互作存在脂质特异性[29-31]，而冻融细胞磷脂双分子膜脂质的构成决定了AFPs 与细胞膜的相互作用。研究表明，AFPs具有阻断细胞膜离子通道的能力[32-33]。添加AFPs可有效抑制猪颗粒细胞钙离子通道和钾离子通道[34]，从而在低温下提高细胞的存活率。也有研究表明，AFPs的添加会破坏细胞膜的完整性[35]。在AFP家族的N端存在γ-核心序列，目前，γ-核心序列已被证明是AFPs 参与细胞膜互作的关键因素并可以选择性地抑制丝状真菌的生长[36]。巨曲霉菌AFPs 能与真菌膜相互作用并覆盖于真菌膜表面，破坏膜的完整性[36]。向山羊精子抗冻保护液中添加AFPⅢ，冻融后山羊精子质膜出现断裂，且随着AFPⅢ浓度的增加，解冻后精子存活率呈现下降趋势[26]。上述结果表明，AFPs与细胞膜的相互作用与膜的类型和AFPs的浓度有关。

2 AFPs 对精液冷冻保护效果的影响

2.1 AFPs 对精液冷冻保护的效果

与冷冻保存细胞相比，精子质膜富含多不饱和脂肪酸，更易在冻融过程中受到氧化损伤[37]。目前，常用的冷冻方法有玻璃化冷冻法、快速冷冻法和低温生物学冷冻法。在冷冻保存精子中通常采用低温生物学方法。冷冻过程中，细胞外冰最先形成，由于渗透压细胞内水向膜外扩散，在快速冷冻过程中细胞内水无法充分排出而导致细胞内冰晶的形成。玻璃化冷冻过程可以避免冻存中细胞内水形成冰晶，但在解冻过程中细胞内会出现大量冰晶，从而对细胞造成损伤。因此，应根据细胞类型对冷冻速率和冷冻保护剂进行优化；而添加AFPs 则可减少冻融过程中冰晶造成的机械损伤。

目前，研究表明，向抗冻保护稀释液中加入1 μg/mL的AFPⅠ可以显著改善冷冻复苏后鲤鱼精子的活力和活率[38]。在利用液氮蒸熏法冷冻保存水牛精液的试验中，添加10 μg/mL 赤翅甲抗冻蛋白（Dendroides canadensis antifreeze protein, DAFPs）显著提高了冻融后的精子活力[39]。CHAVES 等发现，向冷冻保护剂中添加0.5～1 μg/mL AFPⅢ后显著提高了冻融后的胚胎发育率[40]。AFPs 作为一种新型冷冻保护剂或抗冻保护添加剂可显著改善解冻后细胞的存活率[41]。表1总结了近5年来AFPs作为冷冻保护剂或抗冻保护添加剂的研究进展。尽管AFPs 可以提高冻后细胞存活率已被大量研究证实，但关于AFPs 作为一种潜在冷冻保护剂依然存在争议[42-43]。例如：向鲟鱼精子冷冻保护剂中添加10 μg/mL AFPⅠ，解冻后鲟鱼精子存活率升高，但与不添加AFPⅠ的对照组相比无显著差异；向水牛精子中添加10 μg/mL DAFPs 与不添加DAFPs 对照组相比，精子解冻后存活率没有显著差异[41]；添加AFPs冷冻保存后会破坏细胞膜结构，出现细胞质泄漏和细胞存活率降低的现象[26]。这些研究结果表明，AFPs 的种类、浓度以及冷冻保存方法影响了最终试验结果。因此，在试验中应根据细胞膜脂质类型，选择适合的AFPs 种类、浓度、冷冻保存方法以及冷冻介质，并根据试验进行微调。

精子在冷冻保存中极易受到冷冻打击，造成精子冷休克，表现为精子不可逆的活力丧失[44-45]。研究表明，AFPs可抑制冻融过程中细胞膜多不饱和脂肪酸过氧化，通过优先与多不饱和脂肪酸互作抑制冷冻过程中饱和脂肪酸比例的增加[29]。大量研究表明，AFPs作为一种冷冻保护剂或抗冻添加剂可提高解冻后精子存活率[41,46-49]。添加AFPs可提高精子冷冻效率；然而，一些研究结果表明，AFPs无法改善精子冻融后的活力、活率以及形态。例如：在山羊精子中添加AFPⅢ（0、0.1、1、10、100 μg/mL），伴随AFPⅢ质量浓度的增加精子冻后活力、活率以及精子质膜完整性呈下降趋势；向鲟鱼精子中添加10 μg/mL AFPⅠ，冻存后精子的活力和活率与不添加AFPⅠ的对照组相比差异不显著；向水牛精液中添加DAFPs，精子冻融后活力和活率与不添加相比差异不显著。上述结果表明，在精子抗冷冻保护液中添加AFPs 无法改善精子冻存效率。然而，向水牛精子中添加10 μg/mL DAFPs，－196 ℃冷冻24 h，37 ℃解冻30 s后，精子存活率和精子质膜完整性均高于对照组[41]。其原因可能与AFPs浓度有关：高浓度AFPs 可促使冻融过程中产生的冰晶形成细小针状，可能穿透精子质膜，使精子膜出现断裂，顶体酶发生泄漏。

2.2 AFPs 对冷冻精液保护的影响因素

目前，主要应用的冷冻保护剂在对精子的冷冻保存过程中都存在一定的毒性，例如甘油、乙二醇、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、丙二醇、甲基甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等[50]。而AFPs 在冷冻保存中所表现出的无毒性和特有的生物学特性已成为研究的热点。AFPs 可改变精子冻融过程中精子内外冰晶的形态大小，并与精子质膜相互作用，从而改善冷冻保存的精子品质。精液的冷冻效果与冷冻平衡时间、冷冻方法、选用的冷冻保护剂和冷冻解冻速率均有关系。研究表明，精子在冻融后其线粒体高度肿胀，严重影响了精子线粒体的活性和冻融后精子的前进速度[51]。通过向冻存液中添加DMSO 砜可以保护细胞膜的完整性，但DMSO 添加浓度与线粒体活性呈负相关[52]。AFPs可替代冷冻保护剂及其中的部分甘油或DMSO，从而减少冷冻保护剂的细胞毒性。此外，AFPs会增加冷冻保护剂的溶质浓度。

表1 近5年AFPs冷冻保存生物样品列表Table 1 List of AFPs cryopreserved biological samples in recent five years

目前，在实际生产中冷冻保存精子的技术主要应用于猪和牛，而在禽类实际生产中依然采用鲜精输精[58]。这主要是由于禽类精子的特殊性，在冷冻保存中顶体膜更易受到机械损伤和氧化损伤。相比于猪牛羊的精子，鸡精子头部较小且呈锥柱形，在冷冻保存过程中冷冻保护剂进入精子头部量较少，无法有效改善鸡精子冻存效果；鸡精子的顶体相对较小，在冻融过程中极易发生脱落而导致精子丧失受精能力；此外，鸡精子的尾部较长，在冻融过程中易发生断裂[59-60]。而AFPs在适宜条件下能够改善精子冻融过程中冰再结晶造成的机械损伤，并与精子质膜相互作用而防止顶体的损伤和顶体膜外泄。

3 AFPs 冷冻保护精液的机制

3.1 AFPs 吸附抑制机制

不同AFPs的冰结合位点取决于AFPs的氨基酸序列长度和组成[61]。其作用机制主要为抑制冰晶生长活性。AFPs 在极低浓度条件下可有效抑制冰晶的生长和IRI，但无法降低冰点[62-63]。在冷冻保存下，溶液温度降低，AFPs 选择性吸附在冰晶生长表面，被覆盖AFPs 的冰晶表面无法与水结合而停止生长；然而，在相邻AFPs 之间，冰晶表面没有覆盖AFPs，冰晶与水结合形成冰晶生长通路，即未覆盖AFPs 区域的冰晶则沿着平面继续生长形成一个圆形的表面，如图1所示。

图1 AFPs吸附抑制示意图Fig.1 Schematic diagram of AFPs adsorption inhibition

3.2 AFPs 氢键匹配作用机制

AFPs 结构中的谷氨酰胺9、天冬酰胺14、苏氨酸15、丙氨酸16、苏氨酸18 和谷氨酰胺44 构成了AFPs 含羟基氨基酸的平坦表面[61,64]。研究表明，AFPs结构中的上述氨基酸可显著改善热滞性，抑制冰晶的形成，并且AFPs 平坦表面上的含羟基氨基酸可与冰晶主棱镜和冰晶椎体平面相互作用[61]。AFPs 平坦表面与冰晶椎体平面形状互补，AFPs 表面多个亲水基团与冰晶表面氧原子相互匹配形成氢键。AFPs 冰结合位点抑制了冰晶与外围水分子的进一步结合，从而降低冰晶生长活性，改变冰晶最终形态结构，形成六角形双锥体。

4 小结

我国在实际生产中冷冻保存精子的技术主要应用于猪和牛，而在禽类中依然采用鲜精输精，AFPs 为家畜精液冷冻保存提供了一种新的解决方案。由于冷冻保存中AFPs 表现出无毒性和特有的生物学特性，因此，研究AFPs在精子冷冻保护方面具有广阔的前景。目前，AFPs在动物体内提取的含量少，人工合成成本高，在实际应用中仍无法大规模生产AFPs。此外，在冷冻保存中，AFPs与细胞膜的作用机制还有待进一步研究。