SSR标记对部分茶品种的遗传多样性的初步分析

郑刘芳

茶树是我国重要的经济作物之一，我国具有悠久的茶树种植和利用历史，我国也是世界上最先发现和利用茶树的国家。作为一种多年生异花授粉植物，经过长期的自然选择，茶树具有丰富多样的遗传特性。SSR标记技术具有数量多、共显性、多态性好、引物通用性高、重复性好、操作程序简单等优点。目前在多种植物的研究上，SSR标记技术已被广泛应用。本次利用SSR标记技术和4300 DNA分析系统，更快速，准确地完成了实验。

一、材料和方法

1.1材料

23个茶树品种，包括10个安徽黄山茶区的，3个安徽江南丘陵茶区的，5个安徽大别山茶区的，3个福建地区的、1个云南地区的和1个日本数蓓种，取这23个茶树品种的一芽二叶新梢，将采集的样品储藏于-80℃冰箱，备用。

1.2方法

1.2.1DNA的提取与SSR引物合成 采用改良的CTAB法提取DNA，凝胶电泳法观察DNA的完整度，根据4300 DNA分析系统的检测原理，进行PCR扩增，通过4300 DNA分析系统进行成像检测。

1.2.2 23个茶树品种的遗传多样性分析

（1）基于4300 DNA 分析系统的SSR-PCR扩增

首先以23个茶树样品的等量混合液为模板、10μl初始体系对gSSR引物进行PCR扩增， 电泳后有扩增条带的，再以优化的体系对混合模板进行PCR扩增;再分别扩增所有23个样品，电泳后统计实验结果。

根据4300DNA分析系统使用手册，优化后的PCR扩增体系：1.0 μl DNA（25 ng·μl-1），0.2 μlM13F-F、0.2 μl R 和0.4 μl IR-M13F，0.8 μl dNTPs（25mmol·L-1），1.0 μl 10× Buffer （含Mg2+），0.1 μl Ex-Taq聚合酶（5U·μl-1），6.3 μl无菌水定容至10 μl。所有引物浓度均为1μmol·L-1。

然后均如下程序扩增：95℃预变性3 min;94℃变性45s，50～60℃（因引物而定）退火1.0 min ，72℃ 延伸45s， 10个循环;再进行 94℃变性30 s，51℃ 退火45s，72℃延伸30 s，25个循环;最后72℃延伸10min，4 ℃保存。

（2）变性聚丙烯酰胺凝胶比较与PCR产物电泳检测

配制acry：bis为29：1，浓度为6.5%的变性聚丙烯酰胺凝胶。在PCR-SSR扩增产物中加入5 μl 2×DNA Loading buffer，混匀离心，94 ℃变性5 min，然后取0.3 μl在4300 DNA自动分析仪上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳条件：电压1 500 V，电流40MA，功率40 W。

1.2.3数据处理与统计分析

根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，采用人工读带方法统计条带。在电泳图上清晰的条带记为“1”，没有条带或者有模糊条带的记为“0”，建立原始数据分析，制作Excel表格，生成“0，1”数据矩阵。根据PIC=1-∑Pi2计算SSR 位点的多态性信息量

采用PopGen 1.32计算不同引物的平均期望杂合度He;平均观测杂合度Ho，以及Nei基因多样性（H）、Shannon信息指数I。使用NTSYSpc-2.10软件系统对供试品种进行聚类，构建树状聚类图。

二、结果与分析

2.1 茶树基因组DNA提取及检测

采用改良的CTAB法，成功地从供试茶树鲜叶样品中提取了基因组DNA。23个茶树基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果显示提取的茶树基因组DNA条带清晰明亮，没有降解，没有弥散， DNA的完整性较好，没有RNA和蛋白质等杂质的污染，符合SSR-PCR的要求。

2.2gSSR的多态性分析

利用23个茶叶品种，对8个gSSR进行多态性分析，共检测到32个等位基因，61个基因型 。平均每对引物能够检测到4.0个等位基因，最多6个，最少2个;平均每对引物能够检测到6.4个基因型，最多11个，最少2个。供试材料的多态性信息量（PIC）变化范围较大，其中引物的PIC最小为0.1190，PIC最大的为0.7209（引物TGS21），平均值为0.4994。

2.3 供试茶树品种遗传多样性分析

依据材料的来源可以将供试的23份茶树品种分为六个种群，采用8个gSSR标记进行群体间遗传多样性研究。结果表明Nei在0.1271（G228）-0.7543（TGS21）变动，平均值为0.5829。Nei值表示在被检测位点上群体中杂合子的频率，是群体杂合程度的度量单位。Nei值越大，反映该群体的遗传变异越多，群体的遗传多样性越高 。

群体的观测杂合度Ho在0.0455（G227）-0.8696（TGS25）之间，平均值为0.4887。期望杂合度He在0.1300（G228）-0.7731（TGS42）之间，平均值为0.5546。Shannon信息指数（I）为0.2489（G228）-1.4901（TGS42），平均值为1.0295。结果说明供试的茶树资源拥有较高的遗传多样性。

2.4 23个茶树样品的聚类分析

使用NTSYSpc-2.10軟件对供试品种进行UPGMA聚类分析，绘制树状聚类分析图。根据32个等位基因相似性矩阵的UPGMA聚类分析表明，在遗传相似系数为0.65时，可以把23个供试品系（种）分为四个大类，第Ⅰ类与第Ⅱ类分别仅包括云抗10号和猪耳种;第Ⅲ类包括黄山种、杨树林种、铁观音、福鼎大白茶;第Ⅳ类包括余下的17个品系（种）。当以遗传相似系数为0.67为阈值时，又可将第Ⅳ类划分为三个亚类，第一亚类包括舒茶早、仙寓早、黄观音、祁门槠叶种和安徽1号，第二亚类仅为横脉种，其余11个品系（种）聚为一类，其中茗洲种与日本数蓓种的遗传相似系数较高，达到了0.78。聚类结果说明，安徽地区的主要茶树栽培品种与福建地区的茶树品种亲缘关系较近，与云南地区的茶树品种亲缘关系较远，符合品种演化规律。

三、结论

（1）茶树鲜叶基因组DNA的提取在黄建安方法的基础上，进行了适当的改进，成功的从供试的23份茶树鲜叶样品中提取了高质量的基因组DNA。

（2）建立了基于4300 DNA遗传分析系统的SSR-PCR反应体系，且可以以自行配制的聚丙烯酰胺凝胶溶液替代该系统指定用胶。

（3）对8个gSSR进行多态性分析，共检测出32个等位位点和61种基因型;SSR具有丰富的位点多态性。

（4）在遗传相似系数为0.65时，可以把23个供试品系（种）分为四个大类，第一类与第二类分别仅包括云抗10号和猪耳种;第三类包括黄山种、杨树林种、铁观音、福鼎大白茶;第四类包括余下的17个品系（种）。