化学发光免疫分析技术及其在农药残留检测中的应用进展

王春琼，张燕，李苓，陈丹，彭丽娟，曾彦波

（1.云南省烟草质量监督检测站，昆明 650106； 2.云南大学生态与环境学院，昆明 650504）

蔬菜、水果等农产品在生产过程中不可避免地会遭受多种病虫害危害，致使产量降低、质量下降，因此在果蔬生长过程中常需要喷洒农药，以防治病虫害，但长期不妥当、过量喷洒农药，甚至违规使用国家早已禁用的高毒农药，造成农产品中农药残留问题较为突出，严重影响农产品的质量安全，危害人体健康［1］。随着人们环保意识的提高，国内外逐渐加强对农药残留管控，而及时有效地检测农产品中农药残留量，是农药残留管控的有效手段［1］。

现行的农药残留监控方法主要依靠实验室大型分析仪器，存在检测成本高、专业性强、分析周期长、结果反馈滞后等问题［2–6］。农药残留快速检测方法［7–10］以酶抑制等理化方法为主，具有检测速度快、成本低，适合对批量样本筛查等优点，缺点是该方法依赖于颜色变化，受样品组织液干扰较大，其检出限和方法灵敏度的进一步提高受到了局限。随着检测监管要求的不断完善，酶抑制等理化方法已不能满足现场检测及监管的要求。

1977 年Halmann 等［11］提出化学发光免疫分析技术，经过40 年的发展，该技术已比较成熟，其原理是在抗原或抗体上标记发光物质进行免疫反应，通过反应剂激发发光物质形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体重回稳定基态时释放出光子，光信号用自动发光分析仪识别，进而测定光强度，以推算待测样品中抗原或抗体含量。该技术［12］将免疫与化学发光相结合，具有灵敏度高、选择性好、测定范围广、操作简便、成本低廉、快速、易于实现自动化且无放射性污染等优点，近年来在农药残留检测领域发展较快，被称为第三代免疫技术。笔者以化学发光免疫分析为基础，综述了其原理、常见的化学发光剂及化学发光免疫分析方法，并对化学发光免疫分析技术在农药残留检测中的应用进行了介绍，最后对该领域的研究前景进行了展望，旨在为今后农药残留检测相关研究提供参考。

1 化学发光剂

标记用的化学发光物质应满足下述条件：①能进行化学发光反应；②偶联抗体或抗原后可转化为稳定试剂；③偶联后仍然保留高的反应动力和量子产率；④应不影响或极少影响被标记物的理化性质，尤其是免疫灵敏度。常见的化学发光剂有以下几类：

（1）吖啶酯类发光物质。该类发光物质是一种具有三环结构的有机化合物，易氧化，氧化过程无需催化剂。当在碱性环境中氧化时，分子中共价键发生断裂，首先形成一个二氧酮中间体，进而产生电激发的N-甲基吖啶酮，当N-甲基吖啶酮返回到基态时，于430 nm 处发射光子。

（2）鲁米诺类发光物质。鲁米诺及异鲁米诺可在6-氨基进行烷基取代，制得各种衍生物，其中氨丁基乙基异鲁米诺、氨己基乙基异鲁米诺和5-氨丁基乙基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮用于化学发光免疫测定已取得较理想的结果。

（3）咪唑类发光物质。主要以咯吩碱为代表，咯吩碱首先在碱性二甲基亚砜水溶液中反应，生成过氧化物中间体，进而重排，降解，释放光子信号。

（4）苯酚类发光物质。主要以邻苯三酚为代表，属于强还原剂，在催化剂血红素的催化下，与H2O2反应释放光子信号。

（5）芳基草酸酯类发光物质。该类物质发光反应过程是在体系中加入特殊荧光染料，形成荧光载体，在经过氧化草酸酯中间体获取化学能，进而转变为可见光，荧光染料的加入极大地提高了发光效率。

2 化学发光免疫分析方法

2.1 化学发光免疫分析法

化学发光免疫分析（CLIA）法是在抗体或抗原上标记化学发光剂进行特异性免疫反应，通过获取标记物进行化学发光反应时的化学发光强度，推断被标记抗体或抗原的含量。常用的化学发光标记物有鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物，如氨丁基乙基异鲁米诺、氨己基乙基异鲁米诺、邻苯三酚和吖啶酯类。该类分析方法具有以下优点：①准确性和精密度高，均可与放射免疫分析（RIA）法相媲美；②灵敏度高，甚至超越RIA；③检测时间短；④反应试剂无毒，性质稳定；⑤易实现自动化测定；⑥适用性广。缺点是抗原或抗体被标记过发光物质后，会改变免疫反应性能，且发光剂标记率重现性较差。

2.2 荧光化学发光免疫分析法

荧光化学发光免疫分析（FIA）法因受待检样品基质干扰限制，灵敏度大为降低。引入内源光源作为荧光免疫测定的终点检测信号，可有效改善外源光源散射产生的背景噪声，从而大幅度提高信噪比，改善荧光检测的灵敏度。Malant 等［13］利用双-(2，4，6-三氯苯基）草酸酯（TCPO)–H2O2作为发光底物，检测标记荧光素的标记抗体，检出限可达10–11mol／L。但因TCPO 水溶性较差，需要选择适宜的有机溶剂，影响了方法的精密度。该方法目前还未见实际应用的报道，仍停留在研究阶段。

2.3 化学发光酶联免疫分析法

在传统的酶联免疫分析中，酶的活性一般通过荧光法或催化光度法检测，近年来人们采用化学发光反应法检测酶的活性。从标记免疫测定来看，化学发光酶联免疫分析（CLEIA）法应属于酶免疫测定范畴，其检出限低至10–17mol／L，灵敏度优于放射免疫分析法。与传统的酶联免疫分析相比，CLEIA 法通过化学发光检测酶活性，而不是通过荧光法或催化光度法测定。此外某些特殊的金属配合物可催化鲁米诺进行化学发光反应。Muhammad等［4］曾用Co(II)和Fe(II)的配合物代替酶作为抗原（或抗体）的标记物，进行化学发光免疫分析，获得了成功。

2.4 电化学发光免疫分析法

电化学发光免疫分析（ECLIA）是一种新型检测方法，既有别于传统免疫分析法，又不同于普通化学发光分析法。ECLIA 法将化学发光法与电化学法巧妙地结合，具有高效、特异、灵敏、准确和适用性广等特点。与CLIA 法不同，ECLIA 法为电催化化学发光，是在电极表面发生的由稳定的前体物质转变形成的具有高反应活性的发光反应，它是将电化学发光反应的底物作为电化学发光免疫测定中的标记物。ECLIA 法的测定模式与酶联免疫分析（ELISA）法相似，分两个步骤进行。以双抗体夹心法测定抗原为例，首先用三氯联吡啶钉［Ru(bpy)2／3+］配合物标记抗体作为反应物，然后在磁性微球上吸附固相抗体及待检样品。［Ru(bpy)2／3+］配合物和三丙胺（TPA)两种电化学活性底物作为其发光反应的物质基础。

3 化学发光免疫分析法在农药残留分析中的应用研究进展

化学发光免疫分析法作为一种兼具高灵敏度和高特异性的免疫分析方法，在农药残留检测领域已得到了良好的应用。

（1）国外研究进展。Hui 等［14］建立了化学发光酶联免疫分析方法，用于检测农产品中氰基菊酯类农药残留，在最优条件下，测定结果表明，λ-氰氟菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯的半抑制率（IC50）值分别为4.3、1.9、3.4 ng／mL，与传统酶联免疫方法相比较，该方法灵敏度高，检测时间短。Tudorache等［15］建立了磁性粒子化学发光酶免疫法，用于检测样品中的阿特拉津，方法检出限为3 pg／L，线性范围为10～1 000 pg／L，IC50为37 pg／L。Waseem等［16］建立了流动注射化学发光免疫法，用于检测天然水中的西草净，其检出限为7.5 ng／mL，线性范围为0.01～2 μg／L，加标回收率为97%～104%。Jin 等［17］建立了化学发光免疫分析方法，用于检测蔬菜和水果中的三唑磷农药，其检出限为0.063 ng／mL，线性范围为0.04～5.00 ng／mL，加标回收率为67%～122%。Chen 等［18］建立了化学发光免疫分析法，用于检测蔬菜中的敌敌畏，其线性范围为5～8 000 ng／L，检出限为0.42 ng／L，检测速度比传统的酶联免疫分析快。

（2）国内研究进展。陈文梅等［19］以甲基对硫磷分子为识别载体，利用甲基对硫磷–过氧化氢–鲁米诺发光体系，建立了流动注射化学发光分析法。该方法对甲基对硫磷测定具有专一性，甲基对硫磷的浓度在0.08～60 μmol／L 范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.996 9，检出限为0.034 μmol／L。邹如冰［20］发现了一种能同时识别杀螟硫磷、甲基对硫磷和对硫磷的特异性宽谱单克隆抗体，在此基础上建立了化学发光酶联免疫分析方法。该方法能同时测定上述3 种有机磷农药，比较了间接、直接2 种竞争反应模式，确立了最优检测条件。结果表明，直接竞争法检测对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷的IC50分别为5.43、1.34、1.24 μg／kg，线性范围分别为0.39～100、0.10～25、0.10～25 μg／kg；间接竞争法检测对硫磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷的IC50分别为5.57、2.30、2.62 μg／kg，线性范围分别为0.39～100、0.39～25、0.39～25 μg／kg，所建方法满足农产品中上述3 种农药残留的测定要求。

邓浩等［21］建立了化学发光酶联免疫分析法用于检测蔬菜中的对硫磷，IC50为1.14 μg／L，线性范围为0.24～15.83 μg／L，检出限为0.09 μg／L，加标回收率为74.6%～121.0%。杨丽华等［22］建立了化学发光免疫分析法，用于检测农产品中的三唑磷，线性范围为0.16～20 ng／mL，检出限为0.489 ng／mL，该方法与气相色谱–质谱联用法测定结果基本一致。欧阳辉［23］建立了一种动力学分辨免疫分析新方法，可分别在0.6、1 000 s 时收集两种待检物的CL信号，用该方法测定吡虫啉和甲基对硫磷，线性范围均为1.0～500 ng／mL，检出限均为0.33 ng／mL。李明洁［24］基于辣根过氧化物酶–鲁米诺–过氧化氢化学发光体系，建立了测定甲萘威的化学发光免疫分析法，检出限为0.25 μg／L，线性范围为0.25～310.3 μg／L，IC50为3.48 μg／L，用该方法对西红柿、苹果、柑橘样品进行测定，加标回收率为80.0%～107.0%。程燕［25］建立了一种测定农产品中毒死婢的化学发光免疫分析法，结果表明，该方法比传统酶联免疫法线性范围更宽，灵敏度更高。单云等［26］在抗原上标记石墨烯，建立了电化学发光免疫分析法测定蔬菜样品中的噻虫啉，方法检出限为0.05 mg／kg，线性范围为0.1～10 pg／mL。

4 结语与展望

近年来，化学发光免疫分析技术发展迅速，以其独特的优势在食品安全等领域得到了广泛的应用，但在应用中同样存在不足，诸如仪器体积庞大、样品基质干扰大、测定小分子物质精密度低等。为了进一步发展该技术，今后的研究方向应集中在以下几个方面：①仪器向微型便捷化发展；②样品前处理技术应更加高效，降低基质干扰，提高方法的稳定性；③提高检测效率，促进CLIA 技术向多组分检测发展；④发展CLIA 与其它如磁性荧光材料、量子点和多色荧光微球等新型技术的联用技术，进一步扩大应用范围。