昼夜节律、时钟基因与慢性肾脏病发病关系的研究进展

王宜飞，孙倩，夏中元

武汉大学人民医院麻醉科，武汉430060

慢性肾脏病(CKD)是多种肾脏疾病的统称，是由各种原因引起的持续数月的不可逆的肾脏结构和功能异常，主要包括原发性肾小球疾病、继发性糖尿病、高血压肾病及肾血管性疾病等[1]。近年来由CKD导致的终末期肾病(ESKD)数量急剧增加，已成为威胁全球公共卫生的一大难题[2]。昼夜节律生物钟在调节机体日常生理活动中起着基础性作用，肾脏受到中枢生物钟的调控。生物钟的核心时钟元件由经典时钟基因如昼夜运动输出周期蛋白(CLOCK)、芳基碳氢化合物受体核易位体样蛋白1(BMAL1)、周期蛋白(PER1、PER2、PER3)、隐花色素基因家族(CRY1、CRY2)、视黄酸相关孤儿核受体(ROR)α、RORβ和孤儿核受体Rev-Erbα组成，这些核心时钟基因通过协同或拮抗作用在细胞内周期性表达和(或)激活，维持各种生物活动[3]。越来越多的证据表明，睡眠问题或其他不良生活习惯引起的昼夜节律紊乱可能是导致CKD发生发展的重要因素。现就昼夜节律、时钟基因与CKD发病的关系相关研究进展进行综述。

1 肾脏生理昼夜节律及昼夜节律紊乱与CKD发病的关系

1.1 肾脏生理昼夜节律 早在19世纪，学者发现尿液中尿素和水的排泄具有明显的昼夜节律性，白天的尿液排泄量明显比夜间多。随后，肾脏多个生理功能均被证明具有昼夜节律，包括肾小球滤过率(GFR)、肾血流量及肾脏水和主要尿溶质的排泄，其动力学特征为夜间的低谷和活动期的峰值；GFR和肾血流量的昼夜节律振荡幅度在50%左右，而水和电解质在活跃期的排泄量可能较夜间高出数倍。FIRSOV等[3]认为，这可能与肾小管各种电解质转运体周期性激活及加压素受体V1aR、V2R、尿素转运蛋白UT-A2和水通道AQP2基因节律性表达相关。肾脏作为强大的内分泌器官，分泌肾素、促红细胞生成素、活性维生素D和前列腺素等多种激素。血浆肾素活性与血压有着相似的节律，都表现为“晨峰”现象，而促红细胞生成素的峰值出现在傍晚[4]；前列腺素E2的尿排泄表现为下午最高，夜间最低[5]。这些激素分泌呈现出的节律性与肾脏的生理功能紧密相关。

1.2 昼夜节律紊乱与CKD发病的关系 近年来昼夜节律紊乱与CKD的联系受到广泛的关注与研究。一项队列研究表明，长期夜班工作与与钢铁工人早期肾功能不全显著相关[6]。同时流行病学调查发现，睡眠时间过长或过短的人群中患有CKD的比例更高，睡眠时间7～8 h比较合适[7]。针对CKD患者进行的随访亦发现缺乏睡眠或睡眠质量下降的CKD患者GFR恶化速度加快，更容易进展至ESKD[8]。糖尿病是导致CKD发病的重要原因，并且糖尿病肾病一旦确诊通常会缓慢发展为ESKD。时钟基因可通过调节肠道对葡萄糖的吸收，肝脏、肌肉、白色脂肪组织对葡萄糖的代谢，以及胰腺中胰岛素的分泌参与维持血糖稳定的各个环节。因此，昼夜节律紊乱会导致胰岛素抵抗及胰岛素分泌模式或分泌量改变，从而导致糖尿病的发生[9]。此外，高血压也是CKD发生并进展至ESKD的重要病因，尤其是平均睡眠收缩压被认为是CKD最重要的独立预测因子。平均睡眠收缩压每降低一个标准差，CKD患病风险降低27%[10]。正常血压具有明显的昼夜节律性，早上醒来时血压升高，夜晚睡眠时血压降低，这与环境、神经系统、下丘脑—垂体—腺体轴、血管及肾脏等多个具有节律性的因素的调节有关。因此，昼夜节律紊乱导致的夜间血压不降低(非勺型高血压)与CKD的发生和进展相关，但潜在的分子机制尚不清楚[5，11]。这些流行病学与病因学方面的证据提示昼夜节律紊乱与CKD的发生发展密切相关。

2 时钟基因与CKD发病的关系

CKD的病理生理机制相当复杂，目前公认的机制包括自噬失调、炎症反应和过度的氧化应激反应，最终导致肾脏纤维化。时钟基因可能通过调控以上过程参与CKD的发病。

2.1 时钟基因调控肾脏自噬节律 自噬是一种保守的溶酶体降解细胞质成分的途径，肾脏细胞内的固有自噬是维持肾脏内环境稳态、结构和功能的关键，而自噬失调参与了急性肾损伤、急性肾损伤后肾脏的不完全修复及多种病因导致的CKD[12]。研究发现，糖尿病小鼠的mTORC1活化降低可激活自噬，减少足细胞丢失、减轻蛋白尿及肾小球硬化，从而延缓糖尿病肾病的进展[13]。而在单侧输尿管梗阻(UUO)模型中，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)可增强梗阻肾小管细胞凋亡和间质纤维化；依旧在UUO模型中，LC3基因敲除小鼠和beclin-1杂合缺失的转基因小鼠的肾脏表现出TGF-β1导致的胶原蛋白沉积增加，而LC3和beclin-1蛋白均为关键的自噬相关蛋白[14-15]。以上证据表明，适度自噬激活可以抑制肾脏纤维化并延缓CKD的发生发展。CZAJA等[16]发现，肝脏中LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的转化速率在中午阶段达到峰值，随后黑夜阶段下降，说明细胞固有自噬的激活存在明显的昼夜节律性。TFEB和TFE3是MiT-TFE转录因子家族的成员，作为自噬的关键调节因子其以昼夜节律的方式被激活并可直接促进Rev-Erbα表达，而Rev-Erbα抑制Ulk1、Ulk3、Bnip3、Park2、Atg5、Atg7、Bcln1等自噬相关基因的表达，这些基因同时也是TFEB和TFE3激活自噬的靶基因，提示TFEB/TFE3和Rev-Erbα之间的动态平衡与自噬激活的节律调节有关[17]。因此，深入研究时钟基因对自噬节律的调节，对于明确CKD的发生发展机制，寻求新的治疗靶点有着重要意义。

2.2 时钟基因调控CKD炎症反应 持续性低度炎症状态是CKD的显著特征，以循环中持续性低至中度水平的炎症标志物为特点[18]。一项纳入3 430例CKD患者的队列研究表明，TNF-α、IL-6水平是GFR恶化的独立预测因子[19]。研究发现，注射内毒素或者D-半乳糖胺(一种肝毒素)的PER1-/-小鼠，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平更高，而Cry1-/-Cry2-/-小鼠脾脏中的T细胞数量增加，TNF-α水平升高，提示时钟基因可抑制促炎因子的产生从而减缓CKD的进展[20]。核因子κB(NF-κB)是炎症信号通路中的关键分子，其活化会促进肾脏炎症反应。肾脏中NF-κB的激活有两种方式，包括经典通路与非经典通路，大多数肾脏疾病中以经典通路居多，其以RelA/p50异二聚体发生核转移为特征。WANG等[21]研究发现，Rev-Erbα可通过特异性结合RevRE元件抑制RelA的表达，从而抑制NF-κB激活的经典通路。NARASIMAMURTHY等[22]也发现,CRY1的缺失会使细胞内环腺苷酸水平增高并增强蛋白激酶A活化，进而造成RelA磷酸化，最终导致NF-κB激活加强。此外，肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导物可以激活以RelB/p52异二聚体的核转移为特点的NF-κB非经典通路，从而加重肾小管细胞的炎症反应，加速CKD的进展[23]。值得注意的是，RelB作为NF-κB的亚单位可直接结合BMAL1，作为时钟基因表达的负调节因子[24]。因此时钟基因可以通过对NF-κB激活通路的调控从而抑制肾脏疾病相关的炎症反应。近年来，炎症小体已成为CKD发病机制相关研究的热点。炎症小体是多蛋白复合物，在感染和组织损伤时驱动促炎因子的产生，其中NLRP3炎症小体与肾脏疾病的相关性最强[25]。小鼠腹腔巨噬细胞中NLRP3炎症小体组分的mRNA表达水平呈现节律性振荡，在活动期达到顶点，此时为Rev-Erbα mRNA水平最低点，这提示，Rev-Erbα是NLRP3炎症小体的调节因子，可抑制其表达、激活及随后发生的IL-1、IL-18的成熟和分泌[26]。综上，时钟基因在炎症反应中发挥重要的调节作用，而昼夜节律紊乱可能加重肾脏的炎症反应，从而促进CKD的进展。

2.3 时钟基因调控CKD氧化应激反应 早在CKD始发阶段即有氧化应激反应存在，其在肾功能衰竭的发生机制中占有重要地位。多种促氧化酶激活产生过量的活性氧(ROS)，同时伴随抗氧化防御机制即超氧化物歧化酶、过氧化氢酶(CAT)、含硒谷胱甘肽过氧化物酶和对氧磷酶受损，是CKD发生氧化应激反应失衡的核心机制，ROS过量会通过损伤DNA、脂质过氧化以及氨基酸的氧化等对细胞结构及功能造成损伤[27]。而时钟基因可调节ROS的产生和清除。研究发现，BMAL1敲除的小鼠肾脏、心脏和脾脏中ROS聚集显著高于野生型小鼠[28]。SENGUPTA等[29]认为，Rev-Erbα能够促使大鼠肺成纤维细胞线粒体呼吸链激活、FoxO1表达增加及其下游抗氧化基因如锰超氧化物歧化酶，血红素加氧酶1和CAT表达也相应增加，从而起到维持线粒体内稳态和抗氧化应激的作用。KEAP1-NRF2/ARE通路是经典的抗氧化应激通路，也是CKD最具前景的治疗靶点之一。有学者研究发现，核心时钟基因CLOCK和BMAL1能通过启动子上的E-BOX元件调控Nrf2及其下游抗氧化应激蛋白的节律性表达，使其发挥抗氧化应激作用；亦有研究证实Nrf2通过调节BMAL1下游靶点Rev-Erbα的转录间接抑制BMAL1/CLOCK的表达[30-31]。因此，Nrf2和时钟基因组成了一个连锁反应环，将细胞氧化还原信号整合到生物钟节律性变化中。所以时钟基因通过调节抗氧化应激通路控制ROS表达，为减轻CKD氧化应激损伤提供了更多的治疗思路。

2.4 时钟基因调控肾脏纤维化

2.4.1 时钟基因与TGF-β1/Smad通路 TGF-β1是主要的促肾脏纤维化因子，在肌成纤维细胞的活化中有重要作用。在经典的TGF-β1/Smad信号通路中，TGF-β1直接与细胞表面的TGF-β1Ⅱ型受体结合，随之产生的TGF-β1Ⅰ型受体使Smad2、Smad3磷酸化并与Smad4结合形成异二聚体，随后异二聚体转移到细胞核中以增加纤连蛋白、α-SMA、胶原蛋白基因的转录，从而促进肾脏的纤维化[32]。有研究发现，TGF-β1和磷酸化Smad3蛋白在哺乳动物下丘脑视交叉上核中呈节律性地表达。随后，CHEN等[33]进一步证实，在BMAL1/CLOCK异二聚体调控下TGF-β1mRNA表达水平随昼夜节律振荡，并发现在UUO模型中，CLOCK缺失的小鼠TGF-β1水平增高，肾脏纤维化程度更严重。但在一项肺纤维化相关研究中发现，BMAL1敲除会减少TGF-β1所致的磷酸化SMAD3的产生，从而抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化和肺上皮—间充质转化最终延缓肺纤维化[34]。可见时钟基因在TGF-β1/Smad通路中所起的作用具有多样性，这也是未来需要深入研究的问题。

2.4.2 时钟基因与肾纤维化其他相关信号通路 在肾脏中，Wnt/β-catenin通路激活促进许多纤维化相关基因的表达，如Snail1、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI-1)、基质金属蛋白酶7和肾素—血管紧张素—醛固酮系统等[35]。研究发现，内源性CRY1敲除可以促进β-catenin表达和核积累从而抑制脂肪细胞分化[36]。关于前列腺癌的一项研究也发现，时钟基因PER3可抑制肿瘤微环境中的Wnt/β-catenin信号，负性调节前列腺癌干细胞[37]。近年来时钟基因与Wnt/β-catenin信号通路的研究多局限于肿瘤等领域，而在肾脏病方面的研究较为匮乏，但这也为今后肾纤维化的防治提供了新的研究方向。此外，有学者发现，Sonic hedgehog(SHH)与PTCH结合，使得Smo释放产生级联反应，促进转录因子Gli入核，调节纤维化基因表达，导致肾脏纤维化[38]。ZHANG等[39]发现，在小鼠UUO模型中，BMAL1可与Gli2启动子结合，促进Gli2转录，加重肾脏纤维化，这将时钟基因和SHH信号通路联系了起来。

2.4.3 时钟基因与PAI-1 PAI-1可抑制纤维蛋白溶解和促进细胞外基质沉积。研究表明，在小鼠UUO模型中，特异性敲除肾脏成纤维细胞中的PAI-1基因能够抑制小鼠肾小管间质纤维化，认为这种成纤维细胞源性的分泌因子能促进肾脏纤维化[40]。CARMONA等[41]总结了时钟基因调控PAI-1血液浓度节律性变化的分子机制：BMAL1/CLOCK二聚体和RORα分别通过启动子上的E-BOX元件和RORE位点促进PAI-1基因表达，而PER/CRY和Rev-Erbα可竞争性结合以上位点而抑制PAI-1的表达，从而PAI-1与时钟基因的昼夜表达曲线非常相似。因此，时钟基因可通过直接调节PAI-1表达而影响肾脏纤维化的发展。

综上所述，昼夜节律在维持肾脏正常生理功能中起着重要作用。时钟基因表达的节律性紊乱是CKD的发生发展的关键机制。同时，CKD患者普遍存在睡眠障碍，进一步增加了发生昼夜节律紊乱的可能性。因此，在针对CKD的治疗中，昼夜节律是不可忽视的因素，深入了解时钟基因在CKD发生发展中的分子机制可以为临床上改进治疗策略提供参考。通过改善睡眠以及不良的生活习惯，有助于预防CKD的发生和恶化。随着昼夜节律相关机制的逐步阐明，基于时钟基因及其相关信号通路的靶点有望为CKD的治疗带来新的曙光。