TgAb干扰血清Tg检测的相关因素研究进展

程少浩，苏艳军，程若川

昆明医科大学第一附属医院，昆明650031

甲状腺球蛋白（Tg）作为一种甲状腺滤泡上皮细胞分泌的特异性蛋白（660 kDa），通常储存在甲状腺滤泡中，在正常甲状腺滤泡细胞或分化型甲状腺癌（DTC）细胞中均可分泌。甲状腺球蛋白抗体（TgAb）属于G 类免疫球蛋白，主要来源于浸润甲状腺组织的淋巴细胞，常见于自身免疫性甲状腺疾病。Tg 作为DTC 患者甲状腺全切或近全切除术后（不论是否行131I治疗）常规而有效的监测指标，易受到TgAb 的干扰；其次，DTC患者血清TgAb阳性率达30%，TgAb可干扰血清Tg 检测导致Tg 假阴性，使得Tg 不能作为TgAb 阳性DTC 患者随访监测肿瘤复发的血清标志物。本研究对TgAb 干扰血清Tg 检测的相关因素作一综述，以期提高Tg 检测的准确性，为临床医师对TgAb阳性患者的管理提供参考。

1 血清TgAb检测方法的干扰

1.1 TgAb 的异质性 TgAb 的异质性可导致同一样本用不同方法测定的TgAb 相差100 倍，当血清TgAb 较低（1～2 IU/mL）时部分血清表现出这种检测结果的差异性，而TgAb 值很高（＞1 000 IU/mL）的血清则差异性较小［1-2］。SPENCER 等［1］对 785 例患者用4 种不同免疫测定法检测血清TgAb，发现用不同方法检测同一样本的TgAb值不一致，反映了血清TgAb的异质性，认为是由于循环TgAb对Tg抗原、检测试剂和各种方法使用标准的特异性不同而造成的。PICKETT 等［3］也发现了相似的观点，认为TgAb不是单一的分子实体，而是免疫球蛋白混合物，具有与Tg 相互作用的能力。对于测定结果的不一致，在排除了研究对象特异性、Tg 干扰程度以及抗体阳性或阴性样品的特定临界值、TgAb 敏感性等因素外，多考虑与内源性TgAb 具有不同表位有关。目前为止没有一项免疫测定法可以检测出所有的TgAb，大多数的免疫测定法只是检测出了TgAb 的一个子集［1，3］，而其余 TgAb 子集即使没有被检测到，实际上也能干扰Tg的测定。

1.2 TgAb的临界值

1.2.1 TgAb 临界值的分类 目前临床常采用的血清TgAb 截点值包括检测限（LoD）≥0.07 U/mL、功能敏感性（FS）≥0.31 U/mL、制造商临界值（MCO）≥4.11 U/mL、机构临界值（ICO）≥10 U/mL。

1.2.2 TgAb 临界值选取的意义 TgAb 临界值的选取是一个重要而又有争议的问题。根据截点值选取的不同，有研究发现针对不同的TgAb 临界值，所测得的TgAb 状态（阳性或阴性）不同［4-5］。SPENCER等［2］的研究中，当用MCO 作为临界值用于确定TgAb的存在时，许多显示干扰的样本被错误地归类为TgAb 阴性，并且在某些情况下，这些错误分类的样本对 Tg 测定显示出显著干扰。DEKKER 等［6］对 230例患者进行研究发现，在应用LoD＞0.07 U/mL及FS≥0.31 U/mL 分别作为TgAb 阳性的临界值时，所有患者被归类为 TgAb 阳性；而采用 MCO≥4.11 U/mL 时有23.9%的患者为TgAb 阳性，采用ICO≥10 U/mL时仅14.8%患者为TgAb 阳性；该研究认为LoD 和FS 作为定义DTC 患者放射性碘消融治疗期间TgAb阳性的临界水平，在临床实践中并不实用，因为其对Tg 测定值存在严重干扰，使Tg 不能作为肿瘤标记物。由于几乎所有患者的TgAb高于这些临界值，在临床实践中使用MCO 或ICO 作为临界值似乎更合理。与此同时，基于MCO 或ICO 为临界值定义的TgAb 阳性患者与TgAb 阴性患者相比，在肿瘤特征和危险性方面没有差异，这意味着TgAb阳性不应被视为单独的危险因素，也不应该被视为危险分层的独立因素。但是目前为止，尚无关于TgAb阳性定义的临床共识，因为这些研究都是基于所在实验室定义的TgAb临界值来进行的。

2 不同TgAb检测方法间的干扰

2.1 Tg 恢复实验的干扰 目前，TgAb 的检测方法主要是通过Tg 恢复实验间接测定TgAb 和免疫测定法。Tg 恢复实验是将外源性Tg 添加到等分量的血清试剂中，经免疫测定法测定添加前后的Tg 值，添加后与添加前测定的Tg 值比值大于80%则表示无TgAb 干扰［7］。在恢复实验的过程中必须保证添加的外源性Tg 和内源性Tg 在免疫学上表现一致；其次，对于添加的Tg 类型和数量也要严格控制，因为Tg 具有表位特异性，所以正常甲状腺组织、切除后残留甲状腺组织以及肿瘤细胞分泌的Tg 可表现出不同的检测结果；最后，免疫测定法优先测定游离Tg，对于添加外源性Tg 数量过多时，TgAb 结合位点趋于饱和，容易造成游离的外源性Tg 过量，从而使添加前后Tg比值过高，相对于等量外源性Tg来说具有显著的TgAb 干扰作用［7-8］。虽然Tg恢复实验操作简单，但其判断TgAb 干扰的可靠性较差，现已很少应用［3，9］。

2.2 TgAb 免疫测定法的误差 对于TgAb 免疫测定法，由于各个实验室有自己的参考标准，即使大部分的TgAb 检测试剂盒都是根据国际IRP-65/93 参考制剂作为一级标准品进行校准的，但也有研究显示不同的TgAb测定方法间差异较大，使用不同方法测定同一样本中的TgAb存在100倍误差［1］。最近的一项研究评价了11 种自动化免疫检测方法对TgAb检测的一致性，发现检测结果的第25百分位数相差48 倍（0.24 IU/mLvs11.5 IU/mL），第75 百分位数相差30 倍（0.59 IU/mLvs17.97 IU/mL），表明不同方法测定的TgAb 结果差异较大［10］。造成这种不一致的原因可能与Tg 特异性、检测试剂差异、TgAb 敏感性和异质性以及TgAb临界值选取差异等有关，这种方法间的差异极易使血清Tg 检测受到影响，造成DTC 术后管理不当。针对这种差异，临床医生在DTC 患者的随访中必须使用相同方法来监测TgAb水平，另一方面，实验室必须及时通知临床医生TgAb方法的改变，以便重新定义基线。

3 血清Tg检测方法的干扰

Tg分析的功能敏感性定义为在6～12个月内使用至少两个不同批次的试剂和两台仪器校准，测量变异系数为20%的人血清中最低Tg 浓度［13］。对于TgAb 阴性患者的血清Tg 来说，造成Tg 测量误差的原因主要是Tg 的功能敏感性在不同测定方法间的差异以及Tg 的特异性。目前第一代Tg 免疫测定法功能敏感性为0.5～1.0 mg/L，第二代Tg 免疫测定法功能敏感性≤0.1 mg/L，两者相差了至少 5 倍［14］。由于试剂批次和校准器、仪器因素和其他变量的影响，以及DTC 患者血清Tg监测的临床周期较长（6～12 个月），均会导致检测精确度下降，对患者的管理产生负面影响，所以建议实验室使用TgAb阴性患者血清校准该检测的功能灵敏性［15-16］。

不同的Tg 检测方法均需经过BCR®457 进行标准化，在此之前不同方法间的Tg 检测结果差异高达60%［15］。BCR®457 在 Tg 测定标准化中的使用大大降低了方法间的变异性，但是当采用不同方法测定同一样品时，测得的Tg 水平仍然具有显著差异［12］。这些方法间的差异反映了Tg 的特异性，使得不同的检测试剂和检测方法可检测出不同的Tg 亚型。而对于肿瘤来源的Tg，方法间的不一致反映在不同方法报告值之间的异常比率上，这表明当Tg 结构异常时不同的表位可能被掩盖或暴露。

4 TgAb阳性对Tg检测的干扰

TgAb 以定性、定量和方法依赖的方式干扰Tg测定，采用RIA 和IMA 两种方法检测同一血清样本时，Tg IMA 值是降低的，而Tg RIA 值升高或者降低取决于患者TgAb和试剂之间的相互作用。

RIA 是一种非自动化、非同位素且需要较长时间才能达到最高功能敏感性的Tg 分析方法，且在检测过程中可以导致Tg 的假阳性或假阴性。IMA 是一种实验周期短、自动化、功能敏感性高（0.05～1.0 µg/L）的 Tg 测定法，相对于 RIA 来说，IMA 对TgAb 干扰的抵抗力较差，即便是低浓度的TgAb 也会引起Tg 降低甚至检测不到，其原因可能是TgAb结合Tg 时掩盖了单克隆抗体试剂识别所需的表位［5，8］。目前最新的检测方法是 LC-MS/MS，该方法利用胰蛋白酶切割包括TgAb 和其他抗体在内的一切蛋白质，以降低 TgAb 对血清 Tg 的干扰［12］。NET⁃ZEL 等［12］研究比较了 3 种不同的 Tg 检测方法，结果发现对于大多数TgAb 阳性的血清样品来说，LCMS/MS 检测的 Tg 值明显高于 IMA 和 RIA；在 IMA 无法检测到Tg 的情况下，LC-MS/MS 可将检测Tg 的效率提高22%；但是，LC-MS/MS 检测TgAb 阳性患者复发或残留甲状腺癌的临床敏感性却低于功能敏感性≤0.1 mg/L 的IMA（42%vs55%），只有当LC-MS/MS 和IMA 使用相同的功能敏感性（0.5 mg/L）时，LC-MS/MS 检测的敏感性略高于IMA，具有相当的特异性。AZMAT 等［17］也发现了相似的敏感性结果。尽管LC-MS/MS的检测效率较高，但价格昂贵，且无法完全避免TgAb 对血清Tg的干扰，因此LC-MS/MS在临床上的实用性问题仍有待解决［18］。

5 TgAb 对颈部淋巴结细针穿刺（FNA）洗脱液中Tg（FNA-Tg）的干扰

FNA-Tg 检测在鉴别颈部DTC 的复发及转移方面的作用已经得到了证实［19-20］，然而在这些洗脱液中也存在TgAb。目前TgAb对血清Tg的干扰是众所周知的，而TgAb 是否会干扰FNA-Tg 的评估也备受学者关注。

5.1 TgAb阴性对颈部淋巴结FNA-Tg的干扰 TgAb阴性时不会对颈部淋巴结FNA-Tg 产生干扰。JO等［21］对 273 例 DTC 患者的 370 枚可疑颈部淋巴结进行研究，发现在恶性淋巴结中，TgAb 阴性组单独采用 FNA-Tg 与 FNA-TgAb 联合 FNA-Tg 的诊断效果无明显差异；此外，相对于TgAb 阳性组的FNA-Tg（2.5～6.0 ng/mL），TgAb 阴性组在FNA-Tg 为6.0～8.5 ng/mL 时的诊断效能最高。DUVALMA 等［22］对119例可疑的颈部淋巴结转移DTC患者进行评估，发现65例淋巴结转移患者中TgAb阳性和阴性者FNA-Tg无显著差异，提示TgAb水平对FNA-Tg无明显干扰，其原因可能与细胞内Tg不与循环中的TgAb接触有关。

5.2 TgAb 阳性对颈部淋巴结FNA-Tg 的干扰 由于临床数据的缺乏，目前关于TgAb阳性对颈部淋巴结 FNA-Tg 的干扰尚存在争议［21，23-24］。一项回顾性研究发现，TgAb 阳性组和TgAb 阴性组恶性淋巴结内FNA-Tg 水平无明显差异，提示TgAb 阳性不会影响 FNA-Tg［24］。同样，DUVALMA 等［22］也发现了相似的结果。此外，转移性淋巴结中FNA-Tg水平远高于FNA-TgAb 水平，说明转移性淋巴结中Tg 可以克服由于饱和的TgAb结合位点而引起的干扰，并且洗脱液中稀释的TgAb 可以导致颈部淋巴结内TgAb缺失或减少［26］。

但 SHIN 等［23］研究发现，转移性淋巴结中 TgAb阳性组的FNA-Tg 值明显低于TgAb 阴性组，且FNATg 与血清TgAb 之间存在显着相互作用。此外，在1例份TgAb 阳性的转移性颈部淋巴结中未检出FNA-Tg，但病理上Tg染色较强，提示血清TgAb水平过高干扰了FNA-Tg 测定，从而导致假阴性FNA-Tg值，且高浓度TgAb 也与FNA-Tg 敏感性和阴性预测值显著降低相关。同样，JO 等［21］研究发现，良性淋巴结中TgAb 阳性组和TgAb 阴性组的FNA-Tg 无显著差异，而在转移淋巴结中TgAb 阳性组FNA-Tg 水平明显低于TgAb阴性组；且在TgAb阳性患者中，无论是否联合FNAC，FNA-Tg的诊断准确率都比较低。因此，仍然需要更多的前瞻性研究来评估TgAb阳性对颈部淋巴结FNA-Tg的干扰。

6 FNA-TgAb对FNA-Tg的干扰

BOI 等［26］的一项小样本研究同时测定了穿刺洗脱液中的TgAb 和Tg，结果发现有25%的患者FNATgAb阳性，浓度分别为722、162 IU/mL；对于穿刺液中存在TgAb，可能的原因为淋巴细胞的分泌以及穿刺对血液的污染。此外，该研究在穿刺液中检测到TgAb 的2 例患者FNA-Tg 水平明显降低，提示穿刺洗脱液中的TgAb 实际上可能干扰了Tg 的检测。但是，这种干扰似乎对TgAb 阳性患者的FNA-Tg 水平影响很小，因为FNA-Tg 水平均远高于临界值水平，其原因可能是高水平FNA-Tg 患者中高浓度的Tg 能够饱和TgAb的结合位点。

综上所述，血清TgAb 和Tg 是DTC 患者随访中的两个重要血清学指标，TgAb 可对DTC 患者Tg 的测定产生干扰，在TgAb 阳性时导致Tg IMA 值降低，而Tg RIA 值升高或者降低导致Tg 不能作为DTC 随访的可靠肿瘤标记物；FNA-TgAb 阳性可干扰FNATg 值，导致 FNA-Tg 下降，使得 FNA-Tg 在预测颈部淋巴结转移方面效果不佳；而穿刺洗脱液中的TgAb虽可降低FNA-Tg，但这种干扰似乎对TgAb 阳性患者的FNA-Tg影响很小，需要更多的前瞻性研究来探讨。尽管已知TgAb 会干扰Tg 的检测结果，但目前尚无TgAb 阳性的共识性标准，也未能解决关于TgAb干扰Tg的临界水平等相关问题。因此，DTC患者的随访除结合常规的随访指标外，还应进行抗TgAb 干扰的Tg 检测实验，并开展新型的预后指标，如循环上皮细胞、分子标记、DNA测序等。