FGL-1作为LAG-3主要的免疫抑制配体在恶性肿瘤中的研究进展

贾王强 倪红谚 袁龙

郑州大学附属肿瘤医院（郑州450008）

癌症在全世界的病死率和发病率仍然居高不下，每年新增患者1 810 万例，仅2018年因癌症死亡人数达960 万［1］。目前癌症治疗方法主要包括手术、化疗、放疗、免疫治疗以及它们的组合疗法，而免疫治疗被学术界广泛认为是治疗各种癌症最重要的研究成果之一［2］。肿瘤特异性T 细胞在肿瘤进展期间获得的多种抑制性受体的表达可导致其功能失调，而免疫治疗作用于这些抑制性受体以逆转其功能失调，并阻断抗肿瘤免疫反应中抑制T 细胞的途径，重新激活肿瘤特异性T细胞应答反应以促进肿瘤消除［3］。免疫检查点（immune checkpoint）是负向调节T 细胞功能的抑制信号分子，能够抑制细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）在肿瘤中杀伤癌细胞的能力［2，4］。尽管免疫检查点治疗在临床中取得了重大突破，但肿瘤内在抗性导致在实体肿瘤中大量使用免疫检查点抑制剂的反应率很低［2，5］。为了让更多患者从免疫治疗中受益，免疫治疗的重点已转向针对肿瘤微环境中的新型替代免疫检查点［6］，例如淋巴细胞活化基因-3（LAG-3）及其配体纤维介素蛋白-1（fibrinogen like protein 1，FGL-1）等。

LAG3 是一种免疫检查点受体蛋白，主要表达在活化的T 淋巴细胞上［7］。研究表明，主要组织相容性复合物Ⅱ类（MHC-Ⅱ）作为LAG-3的经典配体，LAG-3 与MHC-Ⅱ分子的结合可以下调T 细胞的活性。然而，MHC-Ⅱ是否仅对LAG-3 有抑制功能仍是不清楚的。同时，LAG-3 也可增强调节性T 细胞（Tregs）的抑制活性，通过治疗性抗体抑制LAG-3，可解除LAG-3 对T 细胞的抑制作用，增强机体免疫应答［8-9］。纤维介素蛋白-1 是一种肝细胞分泌蛋白，属于纤维蛋白原家族。在正常生理条件下，FGL-1蛋白主要由肝细胞分泌并促进其有丝分裂和代谢功能［10-11］。最近有研究显示FGL-1 是LAG-3的一个重要的功能性配体，并揭示了LAG-3-FGL-1通路在肿瘤免疫中的作用［12］。FGL-1 作为LAG-3的配体，其在体外和体内以受体-配体相互依赖的方式发挥其对T 细胞的抑制功能。阻断FGL-1-LAG-3 相互作用可以刺激肿瘤微环境中T 细胞的活化和增殖以提高机体对肿瘤的免疫与清除能力。癌症患者血浆中FGL-1升高与预后不良和免疫治疗效果有关［13］。虽然有一些研究对LAG-3 肿瘤免疫中的作用进行了研究，但对于LAG-3-FGL-1通路在肿瘤免疫中的作用及可能的机制相关研究较少。本文旨在总结肿瘤患者与FGL-1 的关系，以及总结FGL-1 蛋白的生物学特征，揭示其可能的免疫学机制，期望能为肿瘤免疫治疗提供新的思路。

1 LAG-3 的结构及功能

LAG-3 是在活化的T 细胞上被发现的含有498个氨基酸的跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞质区3 个部分组成［7-8］。该蛋白的编码区位于人12 号染色体短臂的远端部分，与CD4 的编码区相邻。TRIEBEL 等［14］对LAG-3 的氨基酸序列的分析显示，其具有4 个与CD4 高度同源的细胞外IgSF 域（D1～D4），而D1 的亲和力高于CD4，因此其可以通过干扰MHC-Ⅱ与CD4 的结合来抑制T 细胞活化；LAG-3 可与MHC-Ⅱ相互作用以阻止相同的MHC分子与TCR 和CD4 结合，从而直接阻断免疫反应中的TCR 信号传导通路。然而有研究［15］发现，LAG-3 不能普遍结合MHC-Ⅱ，而是选择性地结合稳定的MHC-Ⅱ复合物（peptide-MHC class Ⅱ，pMHC-Ⅱ），并可优先抑制与稳定的pMHC-Ⅱ反应的T 细胞的活化。此外，LAG-3 不会干扰CD4-pMHC-Ⅱ和TCR-pMHC-Ⅱ的相互作用。LAG-3 的IC 区由约60 个氨基酸残基组成，LAG-3 的抑制功能需要其细胞内的IC 区域参与，这表明LAG-3 会通过其IC 区域转导抑制信号。LAG-3 细胞质尾部的分子结构与其他免疫检查点截然不同，它具有3 个结构域：第1 个区域是丝氨酸磷酸化位点；第2 个区域是含有KIEELE 基序的单个赖氨酸残基，此结构域对调节CD4+T 细胞的功能至关重要；第3 个区域是谷氨酸-脯氨酸重复序列，与LAG-3 相关蛋白（LAG-3 related protein，LAP）结合，有助于定位LAG-3。在这3 个区域中，KIEELE 基序对信号转导和LAG-3 的抑制功能是不可或缺的［16］。

2 肿瘤及TIL 中的LAG-3

2.1 LAG-3 在肿瘤中的表达与作用LAG-3 在多种恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。在慢性淋巴细胞性白血病中，LAG-3高表达患者的疗效较差［17］。在肝细胞癌中LAG-3的高表达与肿瘤进展密切相关［18］。在胃癌中，LAG-3 在CD4+T 和CD8+T 细胞上的表达升高，可能会损害细胞介导的免疫功能［19］；LAG-3 在黑色素瘤的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）上表达与黑色素瘤的TNM 分期及预后有关［20］；LAG-3 在乳腺癌患者中的表达与其存活率呈正相关，与复发风险呈负相关［21-23］；在卵巢癌中，LAG-3在纽约食管鳞状细胞癌-1（NY-ESO-1，New York esophageal squamous cell carcinoma-1）诱导的特异性CD8+T 细胞上高表达，使其产生IFN-g 和TNF-a 的能力下降；此外，LAG-3 在肺癌及结直肠癌等恶性肿瘤中均高表达且与疾病预后有一定的关系［23］。

2.2 LAG-3 在TIL 中的表达与作用在肿瘤进展期间，肿瘤浸润性CD4+T 细胞会慢慢衰竭，LAG-3的表达也会升高［24］。编码LAG-3 分子与编码CD4分子基因的染色体定位相同，拥有共同的外显子和内含子，因此LAG-3 与CD4 可能是同一基因复制进化而来的。TRIEBEL 等［14］发现MHC-Ⅱ类分子是LAG-3 和CD4 的共同配体，LAG-3 与CD4 的同源性表明其可以结合MHC-Ⅱ类分子，LAG-3 通过与MHC-Ⅱ类分子结合并相互作用抑制特异性CD4+T 细胞的增殖。ASCIERTO 等［9］发现，在CD4+T 细胞中的Th1 上可检测到LAG-3，而在大部分Th2 上不能检测到，这说明LAG-3 可作为区分Th1和Th2 的表面标志物。然而后来又有研究［25-26］认为，LAG-3 表达可能无法可靠地区分Th1 和Th2。LAG-3 在未活化的CD8+T 细胞表达较少，而当受相应的抗原刺激后，LAG-3 的表达显著升高。LAG-3在活化的CD8+T 细胞上高水平表达，抑制CD8+T 细胞的活化及增殖，从而抑制CD8+T 细胞的抗肿瘤活性。越来越多的研究发现，LAG-3 可在各种类型肿瘤的肿瘤浸润性CD8+T 细胞中过度表达，如卵巢癌、肺癌、结直肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌和其他实体肿瘤［23，27］。此外，LAG-3 分子的mRNA 在CD8+T 细胞表面高表达可导致CD8+T 细胞的功能缺陷。LAG-3 也在Treg 中高表达。最近的研究［28］发现，LAG-3 可以促进Treg 分化，而阻断LAG-3 可以减弱其对Treg 的诱导作用，肿瘤浸润性Treg 在肿瘤进展过程中与PD-1、CTLA-4、LAG-3 和T 细胞免疫球蛋白粘蛋-3（TIM-3，T-cell immunoglobulin mucin-3）等抑制性分子一起可以增强Foxp3 的积累。有研究发现［29］，LAG-3+Foxp3+Treg 细胞在外周血单个核细胞（包括淋巴细胞和DC 等）、TIL 及黑色素瘤、结直肠癌患者的肿瘤组织中高表达，活化的LAG-3+Treg 能够产生IL-10 和转化生长因子-b1（TGF-b1），LAG-3+Treg 细胞具有免疫抑制作用，与肿瘤免疫逃逸相关。LAG-3 潜在的生物学机制最初在活化的NK 细胞上被发现，但LAG-3 对NK 细胞的调控作用在小鼠模型和人细胞模型中的结果并不一致。在小鼠身上的研究发现，敲除LAG-3基因可以导致小鼠NK 细胞自然杀伤活性降低［30］。另有研究发现，LAG-3抗体对人类的NK细胞自然杀伤活性没有特异性影响，然而其机制尚不清楚［31］。根据最近的研究［32］，LAG-3 在浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell，pDC）上表达水平比在任何其他DC 亚群上都高。LAG-3 可以负向调节pDC 的活化，LAG-3 也被认为是pDC 重要的功能标志物。LAG-3 通过基于免疫受体酪氨酸的激活基序（ITAM，immunoreceptor tyrosine-based activation motif）抑制性信号传导途径与MHC-Ⅱ的相互结合抑制DC 的增殖和成熟［33］。LAG-3 在pDC 上高度表达，有助于维持pDC 内环境的稳定［34］。

3 PD-1 联合LAG-3 在肿瘤中的作用

PD-1 作为一种免疫检查点，可以抑制T 细胞活化。许多研究发现通过特异性抗体阻断PD-1可以明显抑制多种肿瘤的进展，如乳腺癌、黑色素瘤、肺癌和结直肠癌等［35-37］。同样，与PD-1 一样，LAG-3 也是一种免疫抑制检查点分子，LAG-3 通过对T 细胞的调节，使抗原特异性CD4+T 细胞增殖减少［38］。已有多项研究使用LAG-3 抗体治疗多种恶性肿瘤，其中包括黑色素瘤、胰腺癌和晚期肾细胞癌［39-40］。然而，关于抗PD-1/LAG-3双特异性抗体在恶性肿瘤中的研究较少，所以有必要开发针对PD-1 和LAG-3 的新型双特异性抗体。FGL-1 作为LAG-3 的配体，在体外和体内以受体-配体相互依赖的方式发挥对T 细胞的抑制作用，阻断FGL-1-LAG-3 的相互作用可以刺激肿瘤微环境中T 细胞的活化和增殖，以提高机体对肿瘤的免疫与清除能力［41-42］。因此，通过阻断FGL-1-LAG-3 通路和阻断PD-1，可以为肿瘤的免疫治疗提供一种新的治疗方法。

4 FGL-1 的结构及功能

FGL-1 是一种肝细胞分泌蛋白，最初是从人肝癌细胞中克隆得到的，并发现其在肝癌患者中高度表达。FGL-1 属于纤维蛋白原家族，其C 端部分有与纤维蛋白原相关的结构域，该结构域存在于肌腱蛋白、纤维白蛋白、血管生成素、纤维蛋白原b和c 链中。FGL-1 与纤维蛋白原β-亚基和γ-亚基的羧基末端氨基酸具有高度同源性，但它不具有纤维蛋白原的3 个功能域：血小板结合位点、交联区和凝血酶敏感位点。以前的研究发现，FGL-1 的表达在再生肝脏中升高，并且FGL-1 可以刺激原代肝细胞中3H-胸苷的摄取，这说明FGL-1 可以促进肝细胞增殖，因此有人认为FGL-1 是肝脏再生因子。然而另有研究发现，FGL-1 对肝癌细胞生长具有抑制作用，提示其在肝细胞增殖中具有抗增殖作用［43］。

5 FGL-1 作为LAG-3 的主要功能配体在肿瘤中的表达及作用

KIM 等［44］采用BioGPS 组织微阵列数据库和蛋白质组分析发现，FGL-1 mRNA 和蛋白质主要在人类正常的肝脏和胰腺组织中表达。Oncomine 数据库的Meta 分析揭示了FGL-1 mRNA 在人类实体肿瘤中高表达的现象，这些肿瘤包括肺癌、前列腺癌、黑色素瘤和结直肠癌等，与正常组织相比，FGL-1 mRNA 在肺癌中具有最高的上调百分比（35%），而在胰腺、肝脏和头颈癌中的表达有所降低。此外，恶性肿瘤基因组图谱数据库显示，FGL-1 在肺腺癌中上调程度最高。FGL-1 在前列腺癌和乳腺癌中也显著上调，但在肝癌中下调。ZHANG 等［45］通过分析50 例胃癌组织及相应癌旁组织中FGL-1的表达，发现胃癌组织中FGL-1 的表达在mRNA 和蛋白水平上均明显高于癌旁组织，FGL-1 在胃癌组织中上调与预后不良相关。

WANG 等［41］采用基因组规模受体阵列技术，使用IgFc 标记的LAG-3 细胞外结构域融合蛋白（LAG-3-Ig）来检测LAG-3 的结合蛋白，FGL-1 被证实是LAG-3-Ig 的主要结合蛋白。FGL-1 与LAG-3相互作用具有高度特异性，WANG 等［41］通过流式细胞术进一步验证了这种相互作用。LAG-3 蛋白由4 个Ig 样细胞外结构域D1～D4 组成，通过结构域缺失研究发现，LAG-3 中D3～D4 结构域的缺失不影响其与FGL-1 的结合，而单独的D1 或D2 可以部分降低结合能力，表明D1 和D2 可以影响FGL与1-LAG-3 的相互作用［7-8］。之前有研究发现，LAG-3 D1 结构域的C 链中的单点突变（Y73F）可以抑制其与MHC-Ⅱ的结合，然而，该单点突变不影响其与FGL1-Ig 结合，这表明FGL-1-LAG-3 相互作用与MHC-Ⅱ-LAG-3结合并不是无用的。WANG等［41］经过研究发现，FGL1 作为LAG-3 的主要功能性配体，在体外和体内以受体-配体相互依赖的方式对T 细胞起抑制作用，FGL1-LAG-3 相互作用也可能影响记忆T 细胞的产生。基因消除或单克隆抗体可以阻断FGL1-LAG-3 相互作用以增强T 细胞应答并促进抗肿瘤免疫能力。此外，抗FGL-1单克隆抗体在LAG-3 缺陷型小鼠中没有抗肿瘤作用，而抗LAG-3 单克隆抗体同样在FGL-1 缺陷型小鼠中丧失功效。FGL-1 是LAG-3 抑制T 细胞反应的主要配体，WANG 等［41］使用FGL1-KO 小鼠的肿瘤模型研究发现，FGL-1 对依赖于LAG-3 的抗肿瘤免疫具有免疫抑制作用，抗FGL-1 单克隆抗体的抗肿瘤作用依赖于LAG-3，而抗LAG-3 的作用依赖于FGL-1 但不依赖于MHC-Ⅱ或其它LAG-3 配体。鉴于FGL-1 在大多数正常组织中表达有限，而在几种人类恶性肿瘤中表达上调，并且与这些肿瘤的预后不良和疗效不佳相关，因此可以高度选择性地对高表达FGL-1 的肿瘤患者进行靶向抗体疗法。FGL-1 与LAG-3 相互作用是一种独立的肿瘤免疫逃逸机制，阻断这种相互作用可能与抗PD 治疗产生协同作用。

6 结语

LAG-3 分子作为一种免疫检查点受体蛋白，在黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胃癌及结直肠癌等多种实体肿瘤中异常表达且与疾病预后有关，说明LAG-3 在肿瘤免疫中发挥重要的调控作用。MHC-Ⅱ是LAG-3 的经典配体，LAG-3 可通过与MHC-Ⅱ分子的结合下调T细胞的活性。然而，MHC-Ⅱ是否仅对LAG-3 的抑制功能负责还存在争议。FGL-1是LAG-3 的一种新发现的配体，在体外和体内以受体-配体相互依赖的方式对T 细胞抑制功能起作用，FGL-1-LAG-3 信号通路可能与恶性肿瘤的免疫逃逸有关，通过阻断此信号通路的传导可能有助于恶性肿瘤的免疫治疗。然而，FGL-1-LAG-3 信号通路具体的免疫逃逸机制仍然未知。此外，LAG-3不同配体的作用机制以及各配体之间是否存在结构与功能的相关性也不清楚。因此，解决这些关键问题有助于优化LAG-3 靶向治疗策略，提高恶性肿瘤的治疗效果。