温度对茶多酚制品中儿茶素、没食子酸和咖啡碱贮藏稳定性的影响

张建勇，王伟伟，崔宏春，薛金金，江和源

（1.中国农业科学院茶叶研究所，农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室，浙江省茶叶加工工程重点实验室，浙江杭州310008；2.杭州市农业科学研究院茶叶研究所，浙江杭州310024）

儿茶素、没食子酸、咖啡碱等茶功能成分具有多种生物活性和药理功效[1]，包括抗氧化[2]，抗癌[3-4]，抗炎[5-6]，降脂减肥[7-8]，降低胆固醇[9]，降血糖[10]等，在普通食品、保健食品、医药、日化用品、功能饲料等均有应用，开发前景非常广阔。儿茶素是茶多酚中含量相对较高、 生物活性较强的化学物质，分为酯型儿茶素和非酯型儿茶素两类，酯型儿茶素包括表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、儿茶素没食子酸酯（CG）等，非酯型儿茶素包括表儿茶素 （EC）、 表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（C）、没食子儿茶素（GC）等[11]。儿茶素具有多个酚羟基的分子结构， 在贮藏和应用的过程中，易受到温度[12-13]、酸碱[14-15]、空气[16]、湿度[17]、金属离子[18-19]等因素影响，发生降解[20]、氧化聚合[21-22]、异构化[23]、脱没食子酰基[24]等反应，从而改变其原有的物化性质、风味品质、生物活性。不同类型的酯型儿茶素和非酯型儿茶素的化学结构不同[25]，决定了其稳定性、氧化还原特性、水解特性、异构特性等均存在较大差异。因此，如何保持其稳定性非常关键， 相关的稳态化技术研究是茶学领域热点研究问题之一。

没食子酸（Gallic acid，GA）是茶叶中可水解多酚类物质的组成部分， 在云南普洱茶中的含量相对较高[26]，不仅与茶叶品质呈正相关，而且具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗突变等多种生物活性[27]。咖啡碱（Caffeine）最早是在咖啡中被发现，但茶叶中的咖啡碱含量比咖啡中的含量高， 咖啡中咖啡碱的含量为1%～2%左右，而茶叶中咖啡碱的含量为2%～5%左右， 约占茶叶生物碱总量的95%以上。咖啡碱不仅是茶叶风味品质特征成分之一， 而且具有强心、利尿、兴奋中枢神经等作用[11]。有关没食子酸和咖啡碱在不同温度条件下的稳定性文献报道相对较少。

温度是影响儿茶素、没食子酸、咖啡碱贮藏稳定性的关键因素， 对其在终端应用体系的物化特性、 风味品质、 生物活性保持具有非常重要的影响。30 ℃是发酵类茶食品、茶酒的发酵温度，而且也是红茶发酵工序叶温重要参数， 温度过高则发酵变化过分激烈、香低味淡、色暗，温度过低则发酵时间延长、内质转化不充分、风味寡淡。60 ℃不仅是普洱茶杀青工艺的控制温度， 而且也是茶点心、茶面包等热加工茶食品贮存的底限温度。文章以-18 ℃冷冻保存为对照， 探索了30 ℃、60 ℃温度条件下茶儿茶素、 没食子酸和咖啡碱的变化规律，分析温度对酯型儿茶素、非酯型儿茶素、没食子酸和咖啡碱的影响， 以期为茶产品贮藏保鲜和稳态化利用研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

98%茶多酚 （无锡太阳绿宝科技有限公司），GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG、CG 等 儿 茶 素标准品（美国SIGMA 公司），没食子酸标准品（美国SIGMA 公司），咖啡碱标准品（美国SIGMA 公司），乙酸（国药集团），乙腈、甲醇色谱纯试剂（美国MERCK 公司）为色谱纯试剂。

Waters 600-717-2998 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司），KQ-100E 型超声波脱气机（江苏昆山市超声仪器有限公司），MR3001 型磁力搅拌器 （德国Heidoph 公司），5810R 型离心机 （德国Eppendorf 公司），DHG-9123A 型电热恒温箱 （上海精宏实验设备有限公司），BCD-528WDPF 冰箱（海尔公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 贮藏稳定性设计

称取0.5 g 的98%茶多酚样品，放入2 mL 带盖圆底塑料管内，加盖密封贮藏，然后分别放置在温度为30 ℃、60 ℃的恒温箱中， 以-18 ℃冰箱贮藏为对照，每隔7 天取样，连续70 天取样，取样后的塑料管不再放回；分别配制1.0 mg/mL 水溶液，HPLC 检测不同取样点的酯型儿茶素（EGCG、GCG、ECG、CG）、非酯型儿茶素（EGC、GC、EC、C）、没食子酸和咖啡碱的含量。

1.2.2 茶儿茶素、没食子酸和咖啡碱HPLC 检测方法

色谱柱Hypersil BDS C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相A 为2%乙酸，流动相B 为100%乙腈，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长280 nm，进样量5 μL，梯度洗脱，流动相B 在12 min内由6.5%线性梯度变化到8%，16 min 变化到15%，20 min 变化到25%，30 min 回到初始状态，平衡5 min。

1.3 数据处理

每个实验重复三次，采用Minitab 19.0 数据处理软件，进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 温度对酯型儿茶素贮藏稳定性的影响

通常情况下，茶多酚、儿茶素类物质适宜低温贮藏。文章以-18 ℃冷冻保存为对照， 考察了30 ℃、60 ℃条件下酯型儿茶素含量变化情况。由图1 可以看出，-18 ℃冷冻保存条件下的EGCG和GCG 含量没有变化。与-18 ℃对照相比，30 ℃和60 ℃条件下随贮藏时间延长，EGCG 含量均呈现逐渐下降的趋势，30 ℃条件EGCG 含量与对照无显著性差异，60 ℃条件下EGCG 含量显著低于对照，60 ℃条件下的EGCG 含量下降幅度明显大于30 ℃条件下。与-18 ℃对照相比，30 ℃条件下随贮藏时间延长GCG 含量呈现逐渐下降的趋势，而60 ℃条件下随贮藏时间延长GCG 含量呈现逐渐升高的趋势， 但均与对照无显著性差异；EGCG含量变化幅度大于GCG 含量变化幅度，说明GCG热稳定性大于EGCG。吴平[28]研究表明，EGCG 在热处理条件下，可能发生差向异构化反应、脱没食子酸化反应、 降解反应以及有氧条件下的氧化聚合反应。结合30 ℃、60 ℃贮藏条件下EGCG 和GCG 含量变化规律， 可以推测，30 ℃条件下，EGCG 和GCG 稳定性较好，但是在60 ℃条件下，EGCG 稳定性显著降低， 部分EGCG 发生了差向异构作用形成GCG， 导致了EGCG 含量快速下降， 而GCG 含量不降反增， 即60 ℃条件下以EGCG 向GCG 转化的差向异构作用为主。

图1 不同温度贮藏条件下EGCG 和GCG 含量变化的动力学曲线Fig. 1 Kinetic curves of EGCG and GCG contents at different storage temperatures

由图2 可以看出，-18 ℃冷冻保存条件下的ECG 和CG 含量没有变化。与-18 ℃对照相比，30 ℃条件下随贮藏时间延长ECG 含量变化较小，与对照无显著性差异， 稳定性较好，60 ℃条件下的ECG 含量下降幅度较大，稳定性较差。与-18 ℃对照相比，30 ℃条件下随贮藏时间延长CG 含量呈现逐渐下降的趋势，而60 ℃条件下随贮藏时间延长CG 含量呈现逐渐升高的趋势， 但均与对照无显著性差异；ECG 含量变化幅度大于CG 含量变化幅度，说明CG 热稳定性大于ECG。结合30℃、60 ℃贮藏条件下ECG 和CG 含量变化规律，可以推测，30 ℃条件下，ECG 和CG 稳定性较好，但是在60 ℃条件下，ECG 稳定性显著降低， 部分ECG 发生了差向异构作用形成CG， 导致了ECG含量快速下降，而CG 含量不降反增，即60 ℃条件下以ECG 向CG 转化的差向异构作用为主。

2.2 温度对非酯型儿茶素贮藏稳定性的影响

儿茶素在相对较高的温度条件下易发生异构化和自动氧化作用[29]。由图3 的不同温度贮藏条件下EGC 和GC 含量变化的动力学曲线可以看出，-18 ℃冷冻保存条件下的EGC 和GC 含量没有变化。与-18 ℃对照相比，30 ℃和60 ℃条件下随贮藏时间延长，EGC 含量均呈现逐渐下降的趋势，30 ℃条件下EGC 含量与对照呈显著性差异，60 ℃条件下EGC 含量与对照呈极显著差异，60 ℃条件下的EGC 含量下降幅度明显大于30 ℃条件下。与-18 ℃对照相比，30 ℃条件下随贮藏时间延长GC 含量基本不变，而60 ℃条件下随贮藏时间延长GC 含量呈现逐渐升高的趋势， 但均与对照无显著性差异；EGC 含量变化幅度大于GC 含量变化幅度，说明GC 热稳定性大于EGC。结合30 ℃、60 ℃贮藏条件下EGC 和GC 含量变化规律，可以推测，30 ℃条件下，EGC 降解或氧化聚合是其稳定性下降的主要作用，而GC 热稳定性较好；60 ℃条件下，部分EGC 发生了差向异构作用形成GC，导致了EGC 含量快速下降；GCG 脱没食子酰基也会变成GC， 但是由于GCG 在60 ℃下几乎没减少，而60 ℃条件下GC 含量不降反增，推测GC 增加的主要原因是EGC 差向异构化作用， 即60 ℃条件下以EGC 向GC 转化的差向异构作用为主。

图2 不同温度贮藏条件下ECG 和CG 含量变化的动力学曲线Fig. 2 Kinetic curves of changes in ECG and CG contents at different storage temperatures

图3 不同温度贮藏条件下EGC 和GC 含量变化的动力学曲线Fig. 3 Kinetic curves of EGC and GC contents at different storage temperatures

由图4 的不同温度贮藏条件下EC 和C 含量变化的动力学曲线可以看出，-18 ℃冷冻保存条件下的EC 和C 含量没有变化。与-18 ℃对照相比，30 ℃条件下随贮藏时间延长EC 含量基本不变，与对照无显著性差异，而60 ℃条件下随贮藏时间延长EC 含量呈现逐渐下降的趋势， 与对照呈显著性差异。与-18 ℃对照相比，30 ℃条件下随贮藏时间延长C 含量逐渐下降，而60 ℃条件下随贮藏时间延长C 含量呈现逐渐升高的趋势， 但均与对照无显著性差异。EC 含量变化幅度大于C 含量变化幅度， 说明C 热稳定性大于EC。结合30℃、60 ℃贮藏条件下EC 和C 含量变化规律，可以推测，30 ℃条件下，EC 和C 稳定性较好， 但是在60 ℃条件下，EC 稳定性显著降低， 部分EC 发生了差向异构作用形成C， 导致了EC 含量快速下降。CG 脱没食子酸也会变成C， 但是由于CG 在60℃下几乎没减少，而60 ℃条件下C 含量不降反增， 推测C 增加的主要原因是EC 差向异构化作用，即60 ℃条件下以EC 向C 转化的差向异构作用为主。

图4 不同温度贮藏条件下EC 和C 含量变化的动力学曲线Fig. 4 Kinetic curves of EC and C contents at different storage temperatures

2.3 温度对没食子酸贮藏稳定性的影响

由图5 的不同温度贮藏条件下没食子酸含量变化的动力学曲线可以看出，-18 ℃冷冻保存条件下的没食子酸含量没有变化。与-18 ℃对照相比，30 ℃条件下随贮藏时间延长没食子酸含量略有降低，而60 ℃条件下随贮藏时间延长没食子酸含量呈现逐渐上升的趋势， 但是30 ℃和60 ℃的没食子酸含量与对照相比均无显著性差异， 即没食子酸在30 ℃和60 ℃温度条件下稳定性均较好。酯型儿茶素EGCG、GCG、ECG、CG 在一定温度条件下，可发生脱没食子酰基作用。结合图1、图2 和图5 结果， 推测60 ℃条件下酯型儿茶素EGCG、GCG、ECG、CG 在发生差向异构作用、降解或氧化聚合的同时，也发生了脱没食子酰基反应，进而出现图5 的60 ℃条件下没食子酸含量随贮藏时间延长不降反升的现象。比较而言，没食子酸在3个温度条件下的稳定性要大于酯型儿茶素、非酯型儿茶素。

图5 不同温度贮藏条件下没食子酸含量变化的动力学曲线Fig. 5 Kinetic curves of gallic acid content at different storage temperatures

2.4 温度对咖啡碱贮藏稳定性的影响

由图6 的不同温度贮藏条件下咖啡碱含量变化的动力学曲线可以看出，-18 ℃冷冻保存条件下的咖啡碱含量没有变化。与-18 ℃对照相比，30 ℃条件下随贮藏时间延长咖啡碱含量基本没有变化，而60 ℃条件下随贮藏时间延长咖啡碱含量呈现略微下降的趋势， 但是30 ℃和60 ℃的咖啡碱含量与对照相比均无显著性差异， 即咖啡碱在30 ℃和60 ℃温度条件下稳定性均较好。将图1、图2、图3、图4 的儿茶素含量变化的动力学曲线，以及图5 的没食子酸含量变化的动力学曲线，与图6 的咖啡碱含量变化动力学曲线比较， 可以看出，在-18 ℃、30 ℃、60 ℃贮藏条件下，咖啡碱的稳定性要大于酯型儿茶素、非酯型儿茶素。

图6 不同温度贮藏条件下咖啡碱含量变化的动力学曲线Fig. 6 kinetic curve of caffeine content under different storage temperature

3 讨论

儿茶素分子结构的固有化学特性， 决定了其在外界环境改变的情况下， 不仅仅会发生差向异构化作用，而且会发生氧化聚合、分解、水解、脱没食子酰基等多种作用， 这些作用之间可能存在竞争或协同作用，在某些特定的条件下，可能有几种作用同时产生。SANG 等[30]、YOSHIHIRO 等[31]研究了茶汤溶液中儿茶素类物质的稳定性， 结果表明，82 ℃有利于儿茶素发生降解和异构化。RYOTA 等[32]研究表明，温度较低条件下茶汤中儿茶素主要发生降解反应，温度超过80 ℃时茶汤儿茶素主要发生异构化反应。WANG 等[33]采用不同温度水浸提茶叶时发现，即使在低温下浸提，茶汤中也有明显的异构化反应， 与此同时， 其他的降解、氧化和聚合等反应也同时存在。目前较多研究集中于茶叶功能成分在不同温度溶液中的稳定性，较少关注固体粉末不同温度条件下的稳定性。

文章研究了不同温度条件下固体茶叶提取物中茶儿茶素、没食子酸和咖啡碱的变化规律，结果表明， 在30 ℃条件下，EGC 以降解或氧化作用为主， 其它儿茶素相对稳定性较好；60 ℃贮藏条件下，酯型儿茶素和非酯型儿茶素以差向异构作用、脱没食子酰基作用为主；GCG 热稳定性大于EGCG，CG 热稳定性大于ECG，C 热稳定性大于EC，GC 热稳定性大于EGC；没食子酸、咖啡碱的稳定性要大于酯型儿茶素、 非酯型儿茶素。文章以-18 ℃冷冻保存为对照， 考察了30 ℃、60 ℃温度条件下儿茶素、没食子酸和咖啡碱的稳定性，可为儿茶素、 没食子酸和咖啡碱等功能成分在食品中的稳态化应用提供理论基础。有关不同温度条件下儿茶素的差向异构化、氧化聚合、降解、脱没食子酰基等多种作用的竞争或协同关系， 以及儿茶素、没食子酸、咖啡碱在食品、饮料、日化用品等不同体系的稳态化应用特性仍有待进一步研究。