13株柔嫩艾美耳球虫分离株对地克珠利及盐霉素耐药情况分析

黄杰，代幸如，殷邵杰，黄俊杰，刘明江，伯若楠，李金贵

(扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009)

柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)是一种细胞内顶复门寄生虫[1]，临床感染可引起鸡的球虫病，易造成死亡率高、耐过鸡生长迟缓或继发其他感染，对现代养鸡业危害十分严重[2]。该球虫寄生于鸡盲肠肠道上皮细胞内，可引起鸡腹泻、血便、生长迟缓、饲料转化率降低，雏鸡感染可致大量死亡。目前，抗球虫药的使用是预防和治疗球虫病的常用手段之一。然而，大规模和长期使用导致鸡肉等产品中残留药物并引起球虫产生耐药性，进而影响公共健康和食品安全[3]。为更好地利用药物，及时了解和评价抗球虫药对当地球虫的治疗效果以便指导生产，对鸡球虫病及球虫抗药性的调查、诊断、研究和分析是保护养鸡业健康发展的必要前提。本试验对不同地区临床分离的13株柔嫩艾美耳球虫进行了地克珠利(DIC)以及盐霉素(SAL)的药物敏感性检测，以期为这些地区防治鸡球虫病的用药策略提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验虫珠

柔嫩艾美耳球虫敏感株或标准株(SE)，由中国农科院上海兽医研究所赠送；来自江苏、山东、福建、安徽、河南分离株共13株，具体情况见表1。

表1 各分离株分离情况

1.2 试验动物

1日龄黄羽肉鸡购自中国农业科学院家禽研究所，试验鸡饲养于经甲醛熏蒸消毒无球虫鸡舍中，饲喂饲料中不添加抗球虫药，饮水使用高压灭菌水。

1.3 主要仪器及试剂

涡旋机WH-1；高速离心机(AnKe公司)；麦克马斯特计数板(中国农业科学院上海兽医研究所)；光学显微镜 (上海莱卡显微镜有限公司)。

胰蛋白酶，购自北京索莱宝科技有限公司；地克珠利溶液，购自天津市保灵动物保健品有限公司，批号20181003；12.96% 盐霉素钠预混剂，购自内蒙古拜克生物有限公司，批号201705018。

1.4 耐药性检测试验

试验鸡饲养至12日龄后称重，并使用SPSS进行随机分组，体重记为试验前体重。每个虫株设DIC给药组、SAL给药组、感染不给药对照组和不感染不给药对照组，每组10只。除不感染不给药组外，其他各组于14日龄分别接种各球虫分离株孢子化卵囊105个。DIC给药组1 mg/kg饮水给药，SAL给药组60 mg/kg拌料给药，各给药组均于13日龄时给药。于接种后168 h将所有鸡称重后扑杀，体重记为试验末体重。

1.5 盲肠病变计分及卵囊计数

感染后168 h将试验鸡剖杀，采取盲肠组织观察其病变情况并记分，按Johnson等1970年的盲肠病变记分标准进行评定，组内平均病变记分乘以10为该组病变值。收集各组盲肠组织，剪碎至1 mm3左右，加入1%胰酶置于37 ℃消化2 h，对各组盲肠匀浆中卵囊个数进行计数，得到相应卵囊值[4]。

1.6 耐药性判定方法及标准

按照黄兵等[5]介绍的方法，以病变计分减少率(reduction of lesion scores, RLS)、相对卵囊产量(relative oocysts production, ROP)、最适抗球虫活性百分率(percent of optimum anti-coccidial activity, POAA) 、抗球虫指数(anti-coccidial index, ACI)等 4项指标综合判定不同虫株对药物的耐药程度。计算公式如下：

ACI= (相对增重率+存活率)-(病变值+卵囊值)，ACI ≥160 判为阴性，ACI <160判为阳性，其中：增重=试验末体重-试验前体重，相对增重率=感染(不)给药组增重/不感染不给药组增重×100%。

RLS=(感染不用药组平均病变计分-感染用药组平均病变计分)/感染不用药组平均病变计分×100%，RLS≥50% 判为阴性，RLS<50% 判为阳性。

ROP=感染用药组平均卵囊百万数/感染不用药组平均卵囊百万数×100%，其中ROP≥15% 判为阳性，ROP<15% 判为阴性。

POAA= (感染用药组GSR-感染不用药组GSR)/(不感染不用药组GSR -感染不用药组GSR)×100%，其中：GSR=笼末重/笼初重，POAA >50% 判为阴性，POAA≤50% 判为阳性。

在全部4项指标中，全部为阴性判定为无耐药性，1项为阳性判定为轻度耐药，2项为阳性判定为中度耐药，3～4项为阳性判定则为完全耐药。

2 结果

2.1 DIC给药组的各项指标

2.1.1 不同地区球虫分离株的ACI比较

根据表2可知，DIC对NT1、NT2、NT3、NT4、NT5、NT7以及HN球虫株的ACI均小于160，耐药性呈阳性，即在使用DIC治疗的情况下，病鸡临床仍出现较为严重的血便症状，同时表现精神沉郁、闭眼缩颈、呆立不动等症状。对其余分离株的ACI均在170以上，临床未见明显球虫病症状，剖检可见盲肠仅有少量出血点，判为阴性。

表2 DIC对不同地区球虫分离株的ACI

2.1.2 综合耐药性判定

根据表3可知，13株虫株的综合判定指标中，NT1、NT2、NT3、NT4、NT5、HN株的4项指标均为阳性，表现为完全耐药；NT7株的4项指标中有2项表现为阳性，判定为中等耐药；SD3株的4项指标中，有一项表现为阳性，判定为轻度耐药；其余各株的4项指标均表现为阴性，判定为无耐药性。

表3 各地区虫株对DIC综合耐药性的判定

2.2 SAL给药组各项指标

2.2.1 不同地区球虫分离株的ACI比较

根据表4可知，使用SAL治疗后，NT1、NT2、NT3、NT4、NT5、NT6、NT7、HN株的ACI均小于160，各组感染鸡剖检均可见盲肠显著缩短，肠壁增厚，有明显盲肠芯，判定为阳性；其余虫株ACI均在160以上，感染鸡临床未见明显球虫病感染症状，判定为阴性。

表4 SAL对不同地区球虫分离株的抗球虫指数

2.2.2 综合耐药性判定

根据表5可知，在所收集并测试13株虫株的指标综合判定中，NT1、NT2、NT4、NT5、NT6、NT7、HN株有3项指标及以上均为阳性，表现为完全耐药；NT3的4项指标中有2项表现为阳性，判定为中等耐药；其余各株的4项指标均表现为阴性，判定为无耐药性。

表5 各地区分离虫株对SAL综合耐药性判定

3 讨论

DIC是我国1997年批准上市的抗球虫药物，最初投放使用时，临床上仅需0.5～1 mg/kg的剂量即可达到非常好的防治效果。赵其平等[6]研究表明，1 mg/kg DIC对柔嫩艾美耳球虫等5个艾美耳虫种的ACI均达到180以上，始终在抗球虫药高效范围内，但应用多年后陆续出现耐药性的报道。在本试验中，南通地区不同鸡场有6株分离株对DIC均表现出强耐药性，河南开封地区1株分离株表现完全耐药，提示这些地区短时间内不宜使用该药物对球虫进行防治，应采用其他药物。

SAL是聚醚类离子载体抗生素的一种，有着较广的抗球虫谱，人们曾经一度认为离子载体类抗球虫药并不会使球虫产生耐药性，但是，由于离子载体类抗球虫药长期而又广泛的使用，球虫抗药株的出现已很普遍[7]。本试验中，南通分离株以及开封分离株均对SAL表现出较强的耐药性，提示该地区不适合使用SAL作为球虫防治药物，由于离子载体类抗生素作用机制类似，容易产生交叉耐药性，所以同类药物也不建议使用，可以选用其他种类药物进行防治。而其余地区分离株并没有对本次检测的2种药物表现严重的耐药性，仍可以选用DIC或SAL对球虫病进行防治。

据流行病学调查显示，当前球虫感染情况依旧严峻[8]。而临床养殖业对鸡球虫病的预防与治疗基本依靠抗球虫药物的添加，但鸡球虫对几乎所有的抗球虫药物都有对应的耐药虫株出现。据黄仪娟等[9]报道，四川部分地区的球虫分离株对多种常用抗球虫药，如：癸氧喹酯、莫能菌素、复方磺胺氯达嗪钠等有着不同程度的耐药性。刘瑞良[10]对湖南醴陵分离株进行药物敏感性试验，结果显示，盐霉素、莫能菌素、二硝托胺等药物对其无治疗效果，表明分离株对多种药物产生了耐药性。大量文献表明，鸡球虫耐药性问题在我国普遍存在[11-14]。本试验采集了来自不同地区共13株柔嫩艾美耳球虫，各分离株均有使用过如磺胺氯吡氢钠等磺胺类药物进行治疗的用药史，但临床仍有发病表现，提示分离株可能对磺胺类药物均有一定程度的耐药性；而且南通分离株以及开封分离株均表现出对DIC以及SAL的耐药性，说明部分临床分离株有多重耐药性，这可能与临床长期使用同种药物进行防治有关。故临床使用抗球虫药物时，应注意药物的交替使用以及联合使用，保证治疗效果同时有利于避免耐药性的产生。崔怡等[15]研究表明，包膜丁酸钠与癸氧喹酯联用可以有效预防球虫病，并对肠道有一定保护作用。另外，中药由于其副作用相对较小，成分复杂不容易产生耐药性，所以临床利用中草药对球虫病进行防治也有着良好的前景。