鸡滑液囊支原体活疫苗(MS-H株)同时免疫对新支二联活疫苗免疫效力影响的调查

华利忠，党海斌，冯志新，袁厅，张磊，刘蓓蓓，甘源，韦艳娜，邵国青*

(1. 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程重点实验室/江苏省生物兽药筛选服务平台，江苏 南京 210014；2. 南昌勃林格殷格翰动物保健有限公司，江西 南昌 330000)

新城疫(Newcastle disease，ND)、传染性支气管炎(infectious bronchitis, IB)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)感染是严重危害养禽业的3种疫病，均呈世界流行[1-3]。流行病学调查显示上述3种疫病病原经常出现混合感染[4-5]，增加了临床防控的难度。目前，新支二联活疫苗被广泛用于防治新城疫和传染性支气管炎。然而因混合感染[6]、联合免疫[7]等各种因素的干扰，临床上新支二联活疫苗经常出现免疫失败，从而导致疾病的暴发。鸡滑液囊支原体感染会降低鸡群免疫力，造成饲料利用率低、生长发育缓慢、淘汰率增加等[6]。由于抗生素耐药性的增加，疫苗免疫对鸡滑液囊支原体病防治起着至关重要的作用。鸡滑液囊支原体活疫苗(MS-H株)是目前国内唯一一个商品化鸡滑液囊支原体活疫苗，可预防及明显减少MS感染引起的临床症状[8]，免疫效果显著。由于新城疫、传染性支气管炎和鸡滑液囊支原体混合感染的普遍存在，多数鸡场不得不面临需要同时免疫上述2种疫苗的情况。然而同时免疫新支二联活疫苗和MS-H活疫苗，是否会造成相互干扰而影响免疫效力还未见报道。本试验利用1日龄SPF鸡，通过对2种疫苗联合免疫以及新支二联活疫苗单独免疫的免疫效果的比较，探讨同时免疫MS-H活疫苗是否会影响新支二联活疫苗的免疫效力。

1 材料与方法

1.1 试验菌株和毒株

试验用疫苗新支二联(威支灵)，2 000只/瓶，批号：19VGIB004，由勃林格殷格翰药业有限公司提供。传染性支气管炎病毒(IBV)M41强毒株由江苏省农业科学院兽医研究所保存提供，-80 ℃保存，鸡胚半数感染量(EID50)的效价为106.4/0.1 mL。试验用MS-H活疫苗，购自澳大利亚生物资源公司，1 000羽/瓶，批号：MSH190121A。

1.2 SPF鸡

100个SPF鸡胚购自济南斯派福瑞禽业科技有限公司，孵化后选用70只健康1日龄SPF鸡用于本次试验。

1.3 试验设计

将70只1日龄健康SPF试验鸡随机分为4组，每组20只，具体分组情况详见表1。其中新支二联苗(威支灵)右眼点眼免疫为1头份(30 μL/只)，MS-H活疫苗左眼点眼免疫1头份(30 μL/只)，IBV M41点眼攻毒50 μL/只(含104EID50的IBV M41)。

表1 试验分组及操作流程

1.4 临床观察及记录

每日观察各组鸡临床症状、发展变化，详细记录试验鸡精神、采食、呼吸、排便等情况。

1.5 血凝抑制试验(HI)检测血清NDV抗体

于试验第21天翅静脉采血0.5 mL，分离血清，HI检测所有试验鸡血清中NDV抗体。HI效价≥3log2判为阳性, <3log2判为阴性。

1.6 剖检采样及气囊病变评分

分别于第26天宰杀全部试验鸡，检查气囊，按照1972年Kleven等的方法进行试验鸡胸气囊和腹气囊的评分。其评分标准为：0分：未发现肉眼可见的气囊损伤；1分：可见淋巴滤泡病变或气囊轻度混浊；2分：气囊有些增厚，通常有小的干酪样渗出物聚集；3分：气囊明显增厚，透明度下降，有单一气囊具有大量干酪样渗出物；4分：气囊明显增厚，透明度下降，有2个或2个以上气囊具有大量干酪样渗出物。统计具有病变的试验鸡只数。另外，每组每只鸡独立工具采集气管，单独包装，保存备用。

1.7 气管IBV再分离试验

选取所有试验鸡的气管组织进行IBV再分离试验。方法：以无菌眼科剪刀取一段剪碎放入2 mL离心管中，加1.5 mL灭菌PBS，匀浆制成组织悬液，4 ℃冷冻离心机12 000 r/min离心10 min，取上清，0.45 μm过滤除菌后用于鸡胚接种(如过滤后样本不足1 mL，灭菌PBS补足1 mL，混匀)。每个气管样品接种5个10日龄SPF鸡胚，0.2 mL/个，继续培养7 d。同时设置不接种的10个鸡胚，作为阴性对照。样品接种后7 d内，每天照蛋1次，剔除接种后24 h内死亡鸡胚。如果24 h内死亡鸡胚多于1个，则该样品结果无效，须重检。而有效检验的样品中任一鸡胚显示典型传支病变，如发育受阻、蜷曲、肾脏尿酸盐沉积、结节状绒毛或于接种后2～7 d内死亡，则该气管拭子样品判为病毒分离阳性。

1.8 RT-PCR检测

采集死亡鸡胚及剖检鸡胚的尿囊液，每个样品接种5个鸡胚尿囊液混样，提取核酸后根据刘帆等[9]的方法，利用GenBank中公布的IBV基因序列(GenBank号：KM586818)，针对3′末端的非编码区(3′ UTR)的保守区合成引物，进行IBV的RT-PCR检测。引物为P1：GGAAGATAGGCATGTAGCTT; P2：CTAACTCTATACTAGCCTAT。RT-PCR一步法反应条件为：50 ℃ 30 min,；95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。

1.9 病理组织观察

各组试验鸡分别采集一小段气管，中性福尔马林固定，制作组织切片，HE染色，观察病理变化。

2 结果与分析

2.1 临床观察

整个试验期间未出现明显的呼吸困难等临床症状，也没有出现关节炎、足垫肿胀等临床变化。但因为腹泻原因共死亡4只，其中G1组死亡1只，G2组死亡3只。

2.2 HI检测血清NDV抗体

NDV的抗体检测结果见表2。 由表2发现G1和G2组的阳性率分别为94.74%和100%，其平均效价分别为4.26log2和4.35log2。其余组均未检测到NDV抗体，阳性率均为0。

表2 血清NDV抗体平均效价和阳性率

2.3 攻毒后剖检气囊评分

气囊评分结果见表3，由表3发现除G1组有1只试验鸡出现气囊气泡外，其余组均未出现气囊的病变。

表3 气囊剖检评分统计

2.4 气管组织 IBV再分离及RT-PCR检测

气管组织IBV再分离时正常胚和侏儒胚的观察见图1，结果统计见表4。G1和G2组IBV分离阳性样本均为2个，阳性率分别为10.53%和11.76%，计算保护率分别为89.47%和88.24%；G3组IBV攻毒对照组阳性数达到18个(18/20)，阳性率达90%；G4组未分离到IBV。说明在本试验条件下，1日龄SPF试验鸡同时点眼免疫新支二联苗(威支灵)和MS-H活疫苗， MS-H活疫苗不影响新支二联苗(威支灵)的免疫保护效率。

图1 正常胚与侏儒胚体型比较

将每个样品接种的5枚鸡胚的尿囊液收集后进行IBV RT-PCR检测，结果G3攻毒对照组检测结果全为阳性，G4组均为阴性，G1和G2组各有2个样本为阳性(见表4)，这一结果与IBV的再分离结果除G3组外其他一致。本试验中，RT-PCR检测方法仅为参考依据，最终评定新支二联苗的免疫效力以气管组织IBV再分离的结果为标准。因为RT-PCR只能检测核酸，不能确定是否为活毒。

表4 气管组织IBV再分离试验及RT-PCR检测结果

2.5 试验鸡气管病理组织学观察

剖检时，每组采集气管，福尔马林固定，进行组织学观察。结果G3 IBV攻毒对照组出现了明显的IBV特征性病理变化，包括：气管黏膜绒毛脱落消失，气管上皮细胞出现胞内包涵体，固有层出现浆细胞和淋巴细胞浸润。G1混合免疫组和G2新支二联免疫组以及G4空白对照组均未出现明显的病理变化(见图2)。

A. G1组；B. G2组；C. G3组；D. G4组图2 各组试验鸡气管组织病理学观察(200×)

3 讨论

多项研究显示新支二联苗的免疫效力会受到各种因素的干扰[10-11]。 为解决此问题，本试验采用了SPF鸡作为试验动物，排除了其他病原混合感染的干扰。结果发现该疫苗单独免疫能够很好地诱导NDV抗体，抗体阳性率达到了100%，IBV再分离指标显示保护率达到88.24%。和对照组相比，气管病理学观察显示单独免疫组并未出现明显的IB病理变化，而IBV攻毒组出现了典型的IB病理变化，包括：气管黏膜绒毛脱落消失，气管上皮细胞出现胞内包涵体，固有层出现浆细胞和淋巴细胞浸润。说明本试验选用的新支二联苗单独无干扰免疫，具有较好的免疫保护效果和较高的安全性。Stephane等[12]对1日龄中国黄羽肉鸡进行了新城疫与传染性支气管炎二联弱毒活疫苗(威支灵)免疫保护试验，结果威支灵免疫组表现出了96.7%的高保护力，与本试验结果一致。

Hopkins等[13]在1982年就对IBV和MS的相互干扰做了很多研究，发现IBV和MS的相互干扰受环境因素、IBV毒力、暴露时间以及接种途径的影响，且IBV疫苗免疫较长时间后接触MS，相互之间没有干扰。但涉及3种活毒(菌)同时点眼免疫是否有相互干扰还不清楚。本研究通过对比发现在免疫MS-H活疫苗的同时免疫新支二联活疫苗，后者诱导的NDV抗体平均效价与单独免疫相比差异不显著。IBV再分离试验以及再分离时鸡胚尿囊液IBV的RT-PCR检出率也没有差异，说明MS-H活疫苗免疫并不干扰新支二联苗的免疫效力。这一现象可能与MS-H的毒力有关，MS-H株为亲本强毒株86079/7NS化学诱变而来，其定殖在上呼吸道系统并诱导抗体反应，即使在最大剂量下，也未发现其引起典型的气囊、关节或气管损伤[14]。Zhu等[15]发现通过比对亲本强毒株以及其他MS毒株发现MS-H具有独特的核苷酸序列，这可能是MS-H株毒力降低的原因。

综上，在本次试验条件下，新支二联疫苗(威支灵)对IBV M41强毒攻击具有较好的免疫保护，保护率高达90%左右，且能诱导试验鸡产生较高的NDV抗体；1日龄SPF鸡同时免疫新支二联活疫苗(威支灵)和MS-H活疫苗，MS-H活疫苗对新支二联活疫苗的免疫效力没有影响。